Спосіб визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь

Є ще 5 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь, що включає підготування дослідних зразків, відділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо відділених мікроорганізмів, проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів, який відрізняється тим, що безпечність харчових продуктів визначають за наявністю мікроорганізмів групи В. cereus і генів токсичності NHE і HBL, при цьому, при визначенні наявності мікроорганізмів групи В. cereus використовують пару праймерів groEL F та groEL R в кількості 0,2-0,3 мкМ, а полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв., а при визначенні генів токсичності NHE і HBL використовують пари праймерів nheA F та nheA R; hblD F і hblD R в кількості 0,15-0,25 мкМ, а мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв.

Текст

Реферат: Спосіб визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь включає підготування дослідних зразків, відділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо відділених мікроорганізмів, проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів. Безпечність харчових продуктів визначають за наявністю мікроорганізмів групи В. cereus і генів токсичності NHE і HBL. При визначенні наявності мікроорганізмів групи В. cereus використовують пару праймерів groEL F та groEL R в кількості 0,2-0,3 мкМ. Полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 3060 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. При визначенні генів токсичності NHE і HBL використовують пари праймерів nheA F та nheA R; hblD F і hblD R в кількості 0,150,25 мкМ. Мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. UA 122751 U (12) UA 122751 U UA 122751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі гігієнічної безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини та екологічної безпеки, а саме до визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь та псування сировини і продуктів. Корисна модель може бути використана в харчовій промисловості, біології, медицині, мікробіології. Відомий спосіб визначення ентеротоксинів та еметичних токсинів, які продукують мікроорганізми В. cereus та інші види роду Bacillus, що були виділені із харчових продуктів [L.I.I. Ouoba, L. Thorsen, A.H. Varman, Int. J. of Food Microbiology, 2008. - № 3 (124). - P. 224-230]. Для визначення наявності як самих мікроорганізмів, так і їх токсинів використовували 41 ізолят представників роду Bacillus, зокрема В. cereus, В. licheniformis, В. megaterium, В. pumilus, В. badius, В. sphaericus і B.fusiformis. Спочатку визначали гемолітичну активність мікроорганізмів скринінгом на кров'яному агарі. Детекція ентеротоксинів мікроорганізмами визначалася за допомогою kits (кітів), зокрема Hbl ентеротоксини з використанням BCET-RPLA, a Nhe-BDEVIA. Детекція генів токсичності проводилася за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) двома методами. В першому методі використовували детекцію кожного гена Hbl A, Hbl С, Hbl D, NheA, NheB, NheC, CytK парою праймерів кожного окремо. В другому використовували дві мультиплексні реакції, тобто для кожної групи (Hbl і Nhe) генів окремо. У випадку визначення Hbl генів використовували три пари праймерів. Первинну денатурацію здійснювали при 95 °C протягом 15 хв., далі - 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 95 °C протягом 30 с, відпал при 52 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 90 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 5 хв. Nhe гени визначали за допомогою ще трьох пар праймерів. Первинну денатурацію здійснювали при 95 °C протягом 15 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 95 °C протягом 30 с, відпал при 55 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 90 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 5 хв. Крім цього визначали за допомогою пари праймерів еметичний специфічний геномний фрагмент ЕМ1. Первинну денатурацію здійснювали при 95 °C протягом 15 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 95 °C протягом 30 с, відпал при 60 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 60 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 5 хв. Ампліфікований продукт охолоджували до 4 °C. Продукти ПЛР ампліфікації були ідентифіковані за допомогою електрофорезу у 1,5 % агарозному гелі. Недоліком способу є складність проведення досліджень, що включають визначення комплексу біохімічних та молекулярно-генетичних властивостей мікроорганізмів, багаторазове проведення ПЛР з одними і тими самими зразками, більш того, за підібраними умовами можливо визначити лише В. cereus, а не представників цієї групи, які теж здатні продукувати токсини. Крім цього додаткові дослідження ізолятів В. cereus для з'ясування генів токсичності, притаманних В. thuringiensis і В. anthracis за допомогою кітів, які були вибрані для визначення токсинів, що продукують мікроорганізми, не дають позитивних результатів, тобто для з'ясування токсичності групи В. cereus не підходять. Більш того, однозначного висновку щодо можливості детекції ентеро- та еметичної токсичності виділених бацилярних штамів не було зроблено. Відомий спосіб визначення 5 генів токсигенних збудників харчових отруєнь групи B.cereus за допомогою мультиплексної композиції [F.Forgani, J.B.Kim, D.H.Oh // J. of Food Science, 2014. - V. 79, № 11, M2288-M2293], яка включала cytK, nheA, CER, hblC, entFM. Завдяки способу можливо одночасно визначити мікроорганізми групи В. cereus (перечислить), при цьому використовують шість пар праймерів (прямий і зворотній) у складі мультиплексної ПЛР, а саме: cytK, nheA, CER, hblC, groEL, entFM. Умови проведення ПЛР: 95 °C, 10 хв → (94 °C, 60 с → 54 °C, 60 с → 72 °C, 60 с) 35 циклів → 72 °C, 5 хв. До складу суміші ПЛР входили по 30 рМ cytK і nheA, по 20 рМ CER, hblC, groEL, 15 рМ entFM із використанням прямих і зворотних праймерів, по 15-20 ng DNA типових штамів, які доводили до 25 мкл сумішшю для ПЛР. Продукти ПЛР ампліфікації були ідентифіковані за допомогою електрофорезу у 2 % агарозному гелі (Sigma-Aldrich, USA). Продукти електрофорезу ідентифікували при Уф-опроміненні з використанням барвника і відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів (Solgent, Korea). Серед 496 штамів, ізольованих з різних джерел, за допомогою чотирьох пар праймерів nheA, entFM, hblC, cytK були ідентифіковані як належні до B.cereus за наявністю генів: nheA92,33 %, entFM-77,21 %, hblC-59,47 %, cytK-47,58 % відповідно. Тобто, важливий моніторинг на гени токсичності, який включає обов'язкове визначення мікроорганізмів, які продукують еметичний токсин та ентеротоксини. Недоліком цього способу є використання від чотирьох до шести пар праймерів, а саме nheA, entFM, hblC, cytK, CER, groEL, що призводить до появи значної кількості варіабельних 1 UA 122751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей рестрикційних фрагментів, які містяться між константними ДНКпослідовностями, мають хаотичний склад послідовностей, змінюють константну ДНКпослідовність, у великій кількості з'являються нерегульовані суміші рестрикційних фрагментів, що заважає проведенню ампліфікації та ідентифікації. Крім цього при умовах, вибраних для проведення ПЛР, були визначені лише чотири гени токсичності, groEL та CER, праймери яких використали для мультиплексної реакції, не були визначені в той же час гени groEL притаманні мікроорганізмам всієї групи В. cereus. Найбільш близьким за технічною суттю до запропонованого способу є спосіб виявлення життєздатних В. cereus, які здатні продукувати токсини (Z. Zhang, L. Feng, H. Xu, C. Liu, N.P. Shah, H.Wei // J. Dairy Sci, 2016. - Vol. 99, № 2. - P. 1-9), згідно з яким здійснюють аналіз токсичності харчових продуктів за допомогою ПЛР із використанням прямих і зворотних праймерів cytK, nheA, nblD. Був використаний типовий штам В. cereus ATCC14579, як ентеротоксинпозитивний мікроорганізм, що продукує три ентеротоксичні гени - cytK, nheA, hblD, який культивували за 37 °C на поживному середовищі протягом ночі. Після цього розділяли живі та мертві клітини обробкою пропідіум моноазидом (ПМА). Геномну ДНК лише живих бактерій екстрагували 3 наступним чином: 1 см зразка центрифугували при 12000 g, 2 хв. при 4 °C і суспендували стерильною водою, з використанням спеціального набору реактивів (Kit, Qiagen, China) згідно інструкції. Очищену мікробну ДНК зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. Для мультиплексної ПЛР використовували загальний об'єм 20 мкл. До складу ПЛР системи включали: 3 мкл геномної ДНК, 10 мкл суміші 2xTaq (Novoprotein Scientific Inc, China), no 0,175 мкМ прямого та зворотного cytK праймера, по 0,25 мкМ прямого та зворотного nheA праймера, по 0,2 мкМ прямого та зворотного hblD праймера. Стерильною дистильованою водою доводили до 20 мкл, 2 мкл використовували для дослідження. Умови проведення ПЛР: початковий цикл 10 хв., 95 °C, наступні 35 циклів денатурації при 95 °C по 30 с (17,5 хв.), ампліфікація при 52,2 °C 30 с, елонгація 72 °C 30 с, фінальна елонгація 72 °C 10 хв. Після ПЛР продукти ампліфікації були ідентифіковані за допомогою електрофорезу у 2 % агарозному гелі при Уф-опроміненні з використанням GoldView (China) барвника і відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів. 3 Зразки продуктів інокулювали 22 КУО/г В. cereus ATCC14579 і змішували з 225 см поживного середовища і гомогенізували 2 хв. та залишали для накопичення культури при 37 °C на 2-5 год. Після цього перемішували, додатково вводили інші збудники харчових отруєнь (колекційні культури St. aureus та Salmonella enteritidis), які інкубували окремо. Зразки центрифугували при 900 х g, 1 хв. при 4 °C для видалення великих шматків продуктів, повторно центрифугували при 12000 х g, 5 хв. при 4 °C. Після двократного промивання і суспендування у стерильній воді геном ДНК був екстрагований після попередньої обробки пропідіум моноазидом (ПМА), а потім підданий аналізу з використанням ПМАмультиплекс ПЛР. Цей спосіб вибрано прототипом. Прототип і корисна модель, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - підготування дослідних зразків; - відділення мікроорганізмів з дослідних зразків; - виділення геномів ДНК з відділених мікроорганізмів; - проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів; - електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів. Але спосіб за прототипом має наступні недоліки: - використання мультиплексної композиції лише для живих мікроорганізмів не є достатньо показовим, оскільки токсини можуть перейти до сировини і продуктів із загиблих бактерій; - не дає змоги одночасного виявлення мікроорганізмів, які відносяться до групи В. cereus і здатні продукувати токсини; - не може комплексно характеризувати безпечність та якість продукту відносно наявності бацилярних контамінантів, оскільки спосіб дозволяє визначити їх лише частково. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь, в якому шляхом проведення досліджень за допомогою ПЛР, які включають після підготовки зразків генів проведення ПЛР в системі, що містить геноми декількох мікроорганізмів, а також використання визначених пар праймерів та інших умов проведення ПЛР, забезпечити підвищення 2 UA 122751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 достовірності отриманих результатів та визначення одночасно мікроорганізмів, які відносяться до групи В. cereus, а також можливість комплексно характеризувати безпечність та якість продукту відносно наявності бацилярних збудників харчових отруєнь. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь, що включає підготування дослідних зразків, відділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо відділених мікроорганізмів, проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів, згідно з корисною моделлю, безпечність харчових продуктів визначають за наявністю мікроорганізмів групи В. cereus і генів токсичності NHE і HBL, при цьому, при визначенні наявності мікроорганізмів групи В. cereus використовують пару праймерів groEL F та groEL R в кількості 0,2-0,3 мкМ, а полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв., а при визначенні генів токсичності NHE і HBL використовують пари праймерів nheA F та nheA R; hblD F і hblD R в кількості 0,15-0,25 мкМ, а мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація мультиплексу при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом можна пояснити наступним. Філогенетичні зв'язки між живими організмами можуть бути простежені шляхом порівняння послідовностей генів ДНК або окремих ділянок рРНК. Особливо широко в таксономічних дослідженнях у бактерій використовуються послідовності генів малої (16S) субодиниці рРНК, оскільки вона має менш протяжний і тому менш мінливий ген в порівнянні з великою (23S) субодиницею. При використанні мультиплексної композиції з великою кількістю праймерів можливо отримання псевдепозитивного або псевдонегативного результату внаслідок утворення. продуктів неспецифічної ампліфікації або часткової інактивації полімерази та виснаження праймерів, що приймають участь в реакції. Можливі також зміни структури зразків генів під впливом високої температури, крім того, підвищена температура може призвести до повної руйнації зразка, утворення значної кількості фрагментів, які можуть заважати проведенню дослідження, а як наслідок - псевдонегативний або псевдопозитивний результат. Діарейний синдром спричиняється потраплянням вегетативних клітин В. cereus, які в тонкому кишечнику продукують комплекс ентеротоксинів: - гемолізину HBL, що кодується hblA, hblC, hblD; - негемолітичного ентеротоксину NHE, що кодується nheA, nheB, nheC; цитотоксину К (Cyt K) - некротичного ентеротоксину, який представлено простим білком у двох формах Cyt K-1 і Cyt K-2, які кодуються відповідними генами Cyt K-1 і Cyt K-2; простого білка ентеротоксину Т (bc-D-ENT) та ентеротоксину FM. Еметичний синдром спричиняється потраплянням вже сформованого еметичного токсину (цереуліда), який може бути присутній в борошняних продуктах. Еметичний токсин дуже стійкий (витримує 126 °C, 90 хв.) і кислотостійкий (рН 2-11). Симптомами отруєння є нудота і блювота через 1-5 годин після потрапляння. В той же час, необхідності ідентифікування цереуліду немає, оскільки типові культури збудників отруєнь (Bacillus cereus ATCC 11778; В. cereus ATCC 14579) його не синтезують, в той же час діарейно-токсичні гени ними виробляються і найбільш показовим із генів токсичності є nheABC (Jung-Beom Kim, Jai-Moung Kim, Cheon-Hyeon Kim, Kyu Seok Seo, Yong-Bae Park, Na-Jung Choi, Deog-Hwan Oh Emetic toxin producing Bacillus cereus Korean isolates contain genes encoding diarrheal-related enterotoxins // Int. J. of Food Microbiology, 2010. - V. 144. - P. 182-186). Hbl складається з трьох протеїнів L2, L1 і В, що кодуються генами hblC, hblD, hblА відповідно і локалізовані в одному опероні. NHE у своєму складі також містить три протеїни NheA (41к Да), NheB (39 кДа), NheC (40 кДа), які кодуються одним nheABC опероном, що містить три гени nheA, nheB, nheC відповідно. Відомо, що гідрофобні сіквенси NheB і HblD більш довгі (~60 залишків), ніж аналогічні в NheC і НblВ. Це може бути пов'язано з тим, що NheB і HblD сіквенси можуть формувати два трансмембранних хелікса і проходити в прямому і зворотному напрямі через мембрани. NheA необхідний для кінцевого етапу при лізисі клітин, тому він вважається найважливішим і саме тому він був вибраний для досліджень. 3 UA 122751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Nhe комплекс пороутворюючого токсину є найбільш важливим в діарейних харчових отруєннях, представлених в ізолятах мікроорганізмів зі зразків харчових продуктів, що викликали отруєння. NHE продукування у B.cereus є найбільш розповсюдженим і виявляється практично у всіх ізолятах - від 92 до 100 %. Група B.cereus, яка включає генетично близькі мікроорганізми визначається за допомогою цільового гена groEL, що кодується праймерами BCGSH (Simultaneous Detection and Identification of Bacillus cereus group Bacteria Using Multiplex PCR/ Park, Si-Hong, Hyun-Joong Kim, Jae-Hwan Kim, Tae-Woon Kim, Hae-Yeong Kim // J. Microbiol. Biotechnol. - 2007, № 17(7), P. 11771182). При цьому використовують п'ять пар праймерів і визначають мікроорганізми групи за допомогою мультиплексної ПЛР. Відомо, що токсичність харчових зразків, обумовлена збудниками бацилярних отруєнь, виявляють не тільки споріднені види, об'єднані в Bacillus cereus group, - Bacillus anthracis, В. cereus, В. mycoides, В. pseudomycoides, В. thuringiensis і В. weihenstephanensis, - а й інші представників роду Bacillus, зокрема, в Paenibacillus cookii, тому важливо з'ясувати не тільки наявність регламентованих мікроорганізмів, але й потенційну токсичність зразків завдяки присутності носіїв генів токсичності. Всього було використано 2 пари видоспецифічних та одна пара групоспецифічних праймерів: - nhe A-F (довжина 17), nhe A-R (довжина 19) для ентеротоксигенного гена nhe А, який характерний для усіх ентеротоксигенних представників виду Bacillus cereus; - hblDF (довжина 20) і hblD R (довжина 18) для визначення діарейного ентеротоксину; - groEL F (довжина 21) і groEL (довжина 20) для визначення групоспецифічного гена В. cereus. Підвищення чутливості і достовірності досягається за рахунок визначення складу використаних пар праймерів (nhe AF та nhe AR; hblDF і hblDR; groEL F і groEL R), що дозволяє збільшити специфічність отримуваних ПЛР-продуктів, спрощення відбувається за рахунок використання одного режиму і однієї мультиплексної ПЛР для всієї групи В. cereus, крім того, використані параметри дозволяють скоротити час дослідження. Технічним результатом даного способу є: - швидке визначення токсичності бацилярних потенційних збудників харчових отруєнь; - підвищення достовірності отриманих результатів завдяки визначенню умов відпалу та кількості проведення циклів реплікації ПЛР; - спрощення процесу визначення мікроорганізмів групи В. cereus, здатних продукувати гени токсичності; - зменшення часу проведення досліджень; - можливість здійснення визначення під час скринінгових досліджень не лише мікроорганізмів групи В. cereus, здатних продукувати гени токсичності, а й інших бацилярних продуцентів мікробних токсинів. Спрощення досягається за рахунок: - можливості одночасного виявлення мікроорганізмів групи В. cereus, здатних продукувати гени токсичності; - використання трьох пар праймерів (пара - прямий - F і зворотній - R), причому nhe AF і nhe AR та hblD F і hblD R реагують на наявність відповідних генів токсичності (HBL і NHE) та групоспецифічної пари праймерів groEL F і groEL R; - використання визначених параметрів відпалу (для генів токсичності t 51-56 °C, τ - час 30 с, на групу В. cereus t 62-65 °C, τ - час 30 с); - зменшення кількості циклів реплікації до 30. Потенційна токсичність зразків харчових продуктів, що може бути встановлена запропонованим способом, визначається якісно, оскільки сама наявність в продукті мікроорганізмів групи В. cereus, з'ясована за допомогою groEL вже свідчить про можливу небезпеку для здоров'я, оскільки генетично запрограмованою особливістю В. cereus є здатність виділяти комплекс характерних токсинів, відповідальних за прояв діарейного та еметичного синдромів. А використання у складі композиції праймерів на гени токсичності Hbl і Nhe дозволяє за допомогою однієї мультиплексної ПЛР підтвердити небезпеку харчових продуктів внаслідок їх наявності. Для імітації інфікування і пошуку генів токсичності бактерій групи В. cereus в зразках консервованої продукції використали типові і колекційні штами мікроорганізмів з колекції культур кафедри мікробіології, вірусології і біотехнології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова і Одеської національної академії харчових технологій, а саме: - Bacillus cereus ATCC 11778; 4 UA 122751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - В. cereus ATCC 14579. Неочевидним є можливість дати сигнал про токсичність навіть не прив'язуючись до виду мікроорганізму, без уточнення комплексу його морфологічних, тінкторіальних, біохімічних і інших хемотаксономічних властивостей і генетичних особливостей, визначуваних при ідентифікації виду. Таким чином за генами токсичності навіть неустановлених видів мікроорганізмів можливо мати сигнал про токсичність, а також визначати безпечність або наявність токсичності харчових продуктів. Для виявлення чутливості ПЛР при ідентифікації ентеротоксигенних бактерій групи В. cereus були застосовані ряд десятиразових розведень суміші добових культур штамів В. cereus (В. cereus ATCC 11778, В. cereus АТСС 10702, В. cereus УКМ В 5650, В. cereus УКМ В 5671) в рідині з консервованої продукції. Усі застосовані розведення були протитровані для виявлення кількості КУО в рідині. 1 2 3 4 5 6 7 Вивчалися наступні концентрації бацил в рідині з консервів: 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 8 3 10 КУО/см . Точне визначення контамінації мікроорганізмами досягається вже при розведенні 2 3 10 КУО/см . Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 ® (SureFast PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Склад суміші для проведення ПЛР: 10хПЛР буфер - 2 мкл, 50 мМ MgCl2-0,8 мкл, 2,5 мМ дНТФ - 1,6 мкл, Taqполімераза (5 Од/мкл) - 0,4 мкл. Очищену мікробну ДНК зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. Цикли ПЛР: для визначення групи В. cereus за допомогою groEL F і groEL R, використовували наступні параметри ПЛР: первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв.; для визначення наявності токсиноутворюючих генів мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію з прямими та зворотними праймерами до генів nheA та hblD здійснювали за наступних умов: первинна денатурація для мультиплексу, що складався з nheAF і nheAR; hblDF і hblDR при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. Стерильною дистильованою водою доводили до 20 мкл, по 2 мкл використовували для дослідження. Як негативний контроль використали деіонізовану воду для контролю чистоти реактивів. Візуальну оцінку розміру утворених ампліконів проводили з використанням маркерів молекулярної маси. Електрофорез продуктів ПЛР з використанням відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів проводили в агарозному гелі з масовою концентрацією агарози 1,5-2 %. ДНК 3 забарвлювали бромістим етидієм (0,5 мкг/см ) і фотографували гель відеосистемою (BioRad, США) під УФ-опроміненням (довжина хвилі 312 нм). Для розробки способу визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних потенційних збудників харчових отруєнь моделювали інфікування штамами В. cereus з колекцій культур кафедри біохімії, мікробіології та фізіології харчування ОНАХТ і мікробіології, вірусології та біотехнології ОНУ імені І.І. Мечникова, а також штамами бацил, ізольованих з промислово поширених в Україні видів рослинної сировини і продуктів їх переробки. Зразки консервів та рослинної сировини було інокульовано добовою культурою 8 кожного із тест-штамів (~10 КУО) у співвідношенні 1:1. Для видалення залишків органічних речовин здійснювали попередню обробку проб рослинної продукції центрифугуванням 1-3 хв. при 900-3000 об/хв. та подальшу фільтрацію через нітроцелюлозні мембранні фільтри "Millipore" d 0,22 мкм або повторне центрифугування протягом 3-5 хв. при 7000-9000 об/хв. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Далі геноми мікробних ДНК піддавали аналізу з використанням мультиплексної ПЛР. Запропонований спосіб дозволяє швидко виявити потенційно небезпечні об'єкти, які містять контамінанти мікробіологічного походження, що важливо для визначення безпечності харчових продуктів і продовольчої сировини та безпеки екології людини, а також моніторингу якості харчових систем. Спосіб здійснюється в наступному порядку. 1. Підготовка дослідного зразка. 5 UA 122751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дослідний зразок готують шляхом змивання зі свіжої сировини (овочі, фрукти, інші плоди) або шляхом її подрібнення і центрифугування для відділення шматків сировини. 2. Відділення мікроорганізмів. Змив або надосадову рідину фільтрують через нітроцелюлозні мембранні фільтри, наприклад, "Millipore", що затримують мікроорганізми або повторно центрифугують 3-5 хв. при 7000-9000 об/хв. 3. Виділення геномів ДНК мікроорганізмів. 3 До фільтру з виділеними мікроорганізмами додають 1 см лізуючого буферу для розчинення 3 клітинних стінок мікроорганізмів, або осад з мікроорганізмами ресуспендують в 1 см лізуючого буферу. Далі виділення геномів мікроорганізмів проводять згідно інструкції до набору F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). 4. Проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Готують систему загальним об'ємом 20 мкл, яка містить 3-5 мкл геномів ДНК виділених мікроорганізмів, 10 мкл суміші для проведення ПЛР: 10х ПЛР буфер (реакційний буфер для проведення ампліфікації, оптимізований для високоспецифічної ПЛР, позначення 10х - коефіцієнт розведення іншими компонентами реакційної суміші, що вносяться) 2 мкл, розчин MgCl2 з молярною концентрацією 0,05 моль/л - 0,8 мкл, розчин дНТФ з молярною концентрацією 0,0025 моль/л - 1,6 мкл, розчин Taq-полімерази з ферментативною активністю 5 Од/мкл - 0,4 мкл (усі реагенти фірми Fermentas, Латвія). Далі готують дві проби: в одну додають дві пари прямих та зворотних праймерів, а саме: nheAF-nheAR, hblD F-hblD R no 0,15-0,25 мкМ, в другу додають groEL FgroEL R no 0,2-0,3 мкМ. Стерильною водою доводять до 20 мкл. З отриманих систем відбирають по 2 мкл, які використовують для подальшого проведення полімеразної ланцюгової реакції. Для nheA та hblD спочатку проводять первинну денатурацію при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 5156 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, потім здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. Для groEL первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. 5. Електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Електрофорез здійснюють з використанням відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів в агарозному гелі з масовою концентрацією 1,5-2,0 %. ДНК забарвлюють бромистим етидієм 3 (0,5 мкг/см ) і фотографують гель відеосистемою, наприклад, BioRad (США) під УФопроміненням при λ=312 нм. За результатами електрофорезу по електрофореграмі визначають наявність або відсутність регламентованих мікроорганізмів. Приклади, які ілюструють здійснення способу. Приклад 1. Об'єкт дослідження - яблука. Сировину подрібнювали, перемішували зі стерильною водою при співвідношенні 1:1, потім для видалення залишків органічних речовин здійснювали центрифугування 2 хв. при 2000 об/хв., далі здійснювали фільтрацію через нітроцелюлозні мембранні фільтри "Millipore" d 0,22 мкм. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Далі геноми мікробних ДНК піддавали ПЛР аналізу: брали дві проби на визначення групи В. cereus та на наявність токсиноутворюючих генів. Умови проведення та результати наведені в таблиці та на Фіг.1, 2. Відсутність смуг на електрофореграмах свідчить про відсутність представників групи В. cereus та генів токсичності Нbl і Nhe. Приклад 2. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але як досліджувану сировину брали суницю, гомогенізували, здійснювали центрифугування 3 хв. при 2000 об/хв. для видалення твердих залишків ягід, потім - повторне центрифугування протягом 5 хв. при 7000 об/хв. Далі аналіз проводили аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 2) та на Фіг. 1, 2. Як свідчать дані електрофореграми, продуктів ампліфікації, які свідчили б про наявність В. cereus та гена токсичності Нbl не виявлено (Фіг.1, 2 смуга 3), в той же час наявні ген токсичності Nhe. Тому необхідним є попередження про особливі технологічні режими переробки та зберігання продукції, яку буде отримано з цієї сировини. Приклад 3. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але досліджували картоплю, робили змиви стерильною водою, здійснювали центрифугування 4 хв. при 2000 об/хв. для видалення твердих 6 UA 122751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 залишків, наявних у змивних водах, потім - повторне центрифугування протягом 2 хв. при 9000 об/хв. для осадження мікрорганізмів. Аналіз ПЛР проводили аналогічно прикладу 2. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 3), Фіг.1, 2 (смуга 4). З електрофореграми видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами 400 п. о. (наявність групи В. cereus) і 617 п. о. (ген токсичності NheA). Приклад 4. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але досліджували харчоконцентрати, а саме, "Суп макаронний курячий", змішували зі стерильною водою у співвідношенні 1:2, здійснювали центрифугування 4 хв. при 1500 об/хв. для видалення твердих залишків харчоконцентратів, потім - повторне центрифугування протягом 2 хв. при 9000 об/хв. Аналіз ПЛР проводили аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 4), Фіг.1, 2, (смуга 5 на Фіг. 1, 2). З даних електрофорезу на Фіг. 1, 2 видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами 400 п. о., 485 п. о. і 617 п. о. (наявні мікроорганізми групи В. cereus та гени токсичності Нbl і Nhe відповідно). Продукція є токсичною і не придатна до вживання. Приклад 5. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але досліджували суміш прянощів "Натуральна приправа для м'яса". Наважку змішували зі стерильною водою у співвідношенні 1:2, здійснювали центрифугування 3 хв. при 2000 об/хв. для видалення твердих залишків сухим трав, потім - повторне центрифугування протягом 2 хв. при 9000 об/хв. Аналіз ПЛР проводили аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 5), Фіг.1, 2 (смуга 6). З даних електрофорезу на Фіг. 1, 2 видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами 400 п. о., 485 п. о. і 617 п. о. (наявні мікроорганізми групи В. cereus та гени токсичності Нbl і Nhe відповідно), тобто продукція є токсичною. Приклади 6-9 ілюструють дослідження наявності мікроорганізмів групи В. cereus в різних консервованих продуктах з ознаками псування. Умови проведення ПЛР і результати наведені в таблиці та на Фіг. 1, 2. Приклади 10-12 ілюструють дослідження наявності мікроорганізмів групи В. cereus на свіжих овочах, модельно контамінованих В. cereus. Приклад 10. Об'єкт дослідження - томатний сік, який був модельно контамінований В. cereus ATCC 11778. Виділення геномів мікроорганізмів проводили згідно інструкції до набору F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Очищену мікробну ДНК зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. ПЛР здійснювали аналогічно прикладу 1. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 10), та на Фіг. 1, 2 (смуга 11). На електрофореграмі наявні смуги, які відповідають визначеним ампліконам розмірами 400 п. о., 485 п. о., 617 п. о., тобто зразок містить мікроорганізми групи В. cereus, гени токсичності Нbl і Nhe - продукція є токсичною. На Фіг.1 позначено: електрофореграма продуктів ПЛР, виділених з рослинної сировини і консервів, зі специфічними олігонуклеотидними праймерами на групу В. cereus: 1. 400 п.о. на групу В. cereus (позитивний контроль нa groEL); 2. негативний результат (зразок з яблук, відсутня смуга на 400 п.о.); 3. негативний результат (зразок з суниці, відсутня смуга на 400 п.о.); 4. позитивна реакція на groEL (зразок з картоплі); 5. позитивна реакція на groEL (зразок суміші прянощів); 6. позитивна реакція нa groEL (зразок "Суп макаронний курячий") 7. позитивна реакція на groEL (зразок консервів "Баклажани в аджиці"); 8. позитивна реакція на groEL (зразок "Сік морквяний"); 9. позитивна реакція на groEL (зразок "Сік мультифрут"); 10. позитивна реакція нa groEL (зразок з консервів "Ікра кабачкова"); 11. позитивна реакція на groEL (зразок "Сік томатний", контамінований культурою В. cereus ATCC 11778); 12. позитивна реакція на groEL (кабачки, контаміновані культурою В. cereus ATCC 11778); 13. позитивна реакція нa groEL (зразок консервованого горошку, контамінований культурою В. cereus ATCC 11778); 14. 400 п.о. на групу В. cereus (позитивний контроль на groEL); 15. маркери молекулярної маси (pBR322 / BsuRI, Fermentas). На Фіг.2 зазначено: 7 UA 122751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 електрофореграма продуктів мультиплексної ПЛР, виділених з рослинної сировини і консервів, зі специфічними олігонуклеотидними праймерами на групу В. cereus: 1. 485 п. о., 617 п. о. (позитивний контроль на гени токсичності Hbl i Nhe відповідно); 2. негативний результат (зразок з яблук, відсутні смуги 485 п. о., 617 п. о.); 3. негативний результат на Hbl, позитивний на Nhe (зразок з суниці - відсутня смуга 485 п. о.,); 4. негативний результат на Нbl, позитивний на Nhe (відсутня смуга 485 п. о., зразок з картоплі); 5. позитивна реакція на Nhe і Hbl (зразок "Суп макаронний курячий"); 6. позитивна реакція на Nhe і Hbl (зразок суміші прянощів); 7. позитивна реакція на Nhe і Hbl (зразок консервів "Баклажани в аджиці"); 8. позитивна реакція на Nhe і Hbl (зразок "Сік морквяний"); 9. позитивна реакція на Hbl, негативна на Nhe (відсутня смуга 617 п. о., зразок "Сік мультифрут"); 10. негативний результат на Hbl, позитивний на Nhe (відсутня смуга 485 п. о., зразок з консервів "Ікра кабачкова"); 11. позитивна реакція на Nhe і Hbl (зразок "Сік томатний", контамінований культурою В. cereus ATCC 11778); 12. позитивна реакція на Nhe і Hbl (кабачки, контаміновані культурою В. cereus ATCC 11778); 13. позитивна реакція на Nhe і Hbl (зразок консервованого горошку, контамінований культурою В. cereus ATCC 11778); 14. 485 п. о., 617 п. о. (позитивний контроль на гени токсичності Hbl i Nhe відповідно); 15. маркери молекулярної маси (pBR322 / BsuRI, Fermentas); 16. негативний контроль ПЛР. Приклад 11. Об'єкт дослідження - кабачки. Здійснювали змиви з поверхні продукту, які контамінували мікроорганізмами В. cereus ATCC 11778. Далі дослідження здійснювали аналогічно прикладу 10. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 11), та на Фіг. 1, 2 (смуга 12). Приклад 12. Об'єкт дослідження - консервований горошок, контаміновані мікроорганізмами 7 5 3 В. cereus ATCC 11778 шляхом додавання типової культури у кількості 10 -10 кл/см при співвідношенні 1:1, перемішували, потім центрифугували 2 хв. при 1500 об/хв. для видалення 3 залишків органічних речовин. Потім 5 см рідини з певним розведенням інокульованих клітинами бактерій, фільтрували крізь мембранні фільтри нітроцелюлози "Millipore" d 0,22 мкм. Фільтр після фільтрації використали для виділення ДНК з використанням експрес-набору, як в попередніх прикладах. Умови проведення та результати наведені в таблиці (зразок 12), та на Фіг. 1, 2 (смуга 13). Приклад 13 ілюструє дослідження наявності генів мікроорганізмів групи В. cereus, а саме, ентеротоксигенного гена nhe А, діарейного ентеротоксину hblD та groEL для визначення групової приналежності до В. cereus. Для дослідження брали типову культуру В. cereus ATCC 11778. Для визначення групової приналежності мікроорганізмів до В. cereus використали прямий і зворотній праймери: groEL F BCGSH-1F 5'- GTGCGAACCCAATGGGTCTTC-3' groEL R BCGSH-1R 5'- CCTTGTTGTACCACTTGCTC-3' довжина амплікону склала 400 п.о. Для визначення діарейного ентеротоксину HBL використали: hblD F 5'-GTTAGATACAGCGAAGCCAC-3' hblD R 5 '-CCGCCAGTTACAACAATA-3' довжина амплікону склала 485.0. Для визначення наявності ентеротоксигенного гена NHE використали: nheA F 5'-AGGTAAATGCGATGAGTAG-3' nheA R 5'-TTGTTGAATGCGAAGAG-3'. Довжина отриманого амплікону склала 617 п.о. Умови проведення ПЛР та результати наведені в таблиці та на Фіг. 1, 2. наведених результатів видно, що в зразку наявні мікроорганізми групи В. cereus (Фіг. 1) та гени токсичності HBL і NHE (Фіг. 2, смуга 14). Для порівняння наведені маркери молекулярної маси (смуга 15). На Фіг. 2 наведена смуга 16 - негативний контроль на чистоту реактивів. 8 UA 122751 U Таблиця Результати ПЛР дослідження наявності генів токсичності бацилярних мікроорганізмів в зразках харчових продуктів № з/п 1 1 2 3 4 5 6 1 7 8 Досліджувані зразки 2 Умови проведення циклів ПЛР 3 Параметри реакції 1 94 °C, 4 хв. → (94 °C, 30 с → 62 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30 циклів →- 72 °C, 5 хв. яблука Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв → (94 °C, 60 с → 54 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. Параметри реакції 1 95 °C, 5 хв → (94 °C, 60 с → 65 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв. суниця Параметри реакції 2 94 °C, 4 хв → (94 °C, 60с → 53 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв. Параметри реакції 1 95 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 64 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. картопля Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 30 с → 54 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. Параметри реакції 1 харчо 94 °C, 3 хв. → (94 °C, 60 с → 65 °C, 30 с → 72 °C, концентрати 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. "Суп Параметри реакції 2 макаронний 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 55 °C, 30 с → 72 °C, курячий" 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. Параметри реакції 1 суміш прянощів 95 °C, 4 хв. → (94 °C, 60 с → 63 °C, 30 с → 72 °C, "Натуральна 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. приправа для Параметри реакції 2 м'яса" 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 30с → 54 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30циклів → 72 °C, 4 хв. консерви з ознаками псування Параметри реакції 1 94 °C, 3 хв. → (94 °C, 60 с → 64 °C, 30 с → 72 °C, "Баклажани в 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв. аджиці" Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 30 с →54 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. 3 Параметри реакції 1 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 63 °C, 60 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. "Сік морквяний" Параметри реакції 2 95 °C, 3 хв. → (94 °C, 30 с → 52 °C, 30 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. Параметри реакції 1 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 63 °C, 30 с "Сік 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. мультифрут" Параметри реакції 2 94 °C, 4 хв. → (94 °C, 30 с → 53 °C, 30 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв. Вид гена hblD nheA 5 6 + + + + + + + + + + + + 4 5 6 + + + 2 9 groEL 4 + → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, UA 122751 U Продовження таблиці 1 9 10 11 12 13 2 3 Параметри реакції 1 95 °C, 3 хв. → (94 °C, 60 с → 62 °C, 60 с "Ікра 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. кабачкова" Параметри реакції 2 95 °C, 3 хв. → (94 °C, 30 с → 51 °C, 30 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. зразки, контаміновані мікроорганізмами Параметри реакції 1 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 63 °C, 60 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. томатний сік Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 30 с → 53 °C, 30 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. Параметри реакції 1 95 °C, 4 хв. → (94 °C, 60 с → 65 °C, 30 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв. кабачки Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 52 °C, 30 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв. Параметри реакції 1 95 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 64 °C, 60 с консервований 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. горошок Параметри реакції 2 94 °C, 5 хв. → (94 °C, 30 с → 52 °C, 30 с 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. Параметри реакції 1 Модельний 95 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 63 °C, 30 с зразок типова 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. культура В. Параметри реакції 2 cereus АТСС 95 °C, 5 хв. → (94 °C, 60 с → 54 °C, 30 с 11778 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв. 4 5 6 + + + + + + + + + + + + + + → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, → 72 °C, ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 Спосіб визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь, що включає підготування дослідних зразків, відділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо відділених мікроорганізмів, проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів, який відрізняється тим, що безпечність харчових продуктів визначають за наявністю мікроорганізмів групи В. cereus і генів токсичності NHE і HBL, при цьому, при визначенні наявності мікроорганізмів групи В. cereus використовують пару праймерів groEL F та groEL R в кількості 0,2-0,3 мкМ, а полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинний відпал при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 62-65 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв., а при визначенні генів токсичності NHE і HBL використовують пари праймерів nheA F та nheA R; hblD F і hblD R в кількості 0,15-0,25 мкМ, а мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація при 94-95 °C протягом 3-5 хв., далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. 10 UA 122751 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 11

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Pylynenko Liudmyla Mykolaivna, Pylypenko Inna Vasylivna, Danylova Olena Ivanivna, Ivanytsia Volodymyr Oleksiiovych, Yamborko Hanna Valentynivna

Автори російською

Пилипенко Людмила Николаевна, Пилипенко Инна Васильевна, Данилова Елена Ивановна, Иваница Владимир Алексеевич, Ямборко Анна Валентиновна

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/00, C12N 15/62, C12Q 1/68

Мітки: харчових, продуктів, отруєнь, безпечності, спосіб, збудникiв, визначення, токсичності, генами, бацилярних

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/13-122751-sposib-viznachennya-bezpechnosti-kharchovikh-produktiv-za-genami-toksichnosti-bacilyarnikh-zbudnikiv-kharchovikh-otruehn.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб визначення безпечності харчових продуктів за генами токсичності бацилярних збудників харчових отруєнь</a>

Подібні патенти