Є ще 92 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб лікування або запобігання раку шлунку, що характеризується злоякісними пухлинними клітинами, експресуючими CLDN18.2, який передбачає введення пацієнтові антитіла, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, в комбінованій терапії із засобом, який стимулює gd Т-клітини, де

(a) антитіло, яке зв'язує CLDN18.2 являє антитіло, здатне опосередкувати знищення клітин, експресуючих CLDN18.2 за допомогою антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (ADCC), опосередковуючої лізис, де антитіло включає важкий ланцюг антитіла, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NО:32 та легкий ланцюг антитіла, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NО:39; і

(b) агент, стимулюючий gd Т-клітини, являє собою бісфосфонат, і де бісфосфонат вводять пацієнтові в комбінованій терапії з інтерлейкіном-2.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що gd Т-клітини є Vγ9Vδ2 Т-клітинами.

3. Спосіб за будь-яким з пунктів 1 або 2, який відрізняється тим, що засіб, який стимулює gd Т-клітини, є азотовмісним бісфосфонатом (амінобісфосфонатом).

4. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-3, який відрізняється тим, що засіб, який стимулює gd Т-клітини, вибирають із групи, яка складається із золедронової кислоти, клодронової кислоти, ібандронової кислоти, памідронової кислоти, ризедронової кислоти, минодронової кислоти,

олпадронової кислоти, алендронової кислоти, інкадронової кислоти та їх солей.

5. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-4, який відрізняється тим, що комбінована терапія додатково включає введення засобу, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, де засіб, що стабілізує або підвищує експресію CLDN18.2 вибирають з групи, яка складається з (і) оксиплатину і 5-фторурацилу, (іі) епирубіцину, оксаліплатину і 5-фторурацилу; (ііі) 5-фторурацилу, фолінової кислоти і оксаліплатину.

6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що експресія CLDN18.2 спостерігається на клітинній поверхні ракової клітини.

7. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-6, який відрізняється тим, що антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, зв'язується з першою позаклітинною петлею CLDN18.2.

8. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-7, який відрізняється тим, що антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, опосередковує знищення клітини за допомогою одного або більше із числа опосередкованого комплементзалежною цитотоксичністю (CDC) лізису,

опосередкованого антитілозалежною клітинноопосредкованою цитотоксичністю (ADCC) лізису, індукції апоптозу й інгібування проліферації.

9. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-8, який відрізняється тим, що згідно з яким важкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NО:17, а легкий ланцюг антитіла включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NО: 24.

10. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-9, який відрізняється тим, що комбінована терапія передбачає введення антитіла, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, у дозі до 1000 мг/м2.

11. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-10, який відрізняється тим, що комбінована терапія передбачає введення антитіла, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, багаторазово в дозі від 300 до 600 мг/м2.

12. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-11, який відрізняється тим, що рак є CLDN18.2-позитивним.

13. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-12, який відрізняється тим, що рак шлунку є аденокарциномою, зокрема, розвитою аденокарциномою.

14. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-13, який відрізняється тим, що пацієнт є пацієнтом з негативним статусом за HER2/neu або пацієнтом з позитивним статусом за HER2/neu, але не придатним для лікування трастузумабом.

15. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-14, який відрізняється тим, що CLDN18.2 має амінокислотну послідовність згідно SEQ ID NО: 1.

Текст

Реферат: Винахід стосується способу лікування або запобігання раку шлунку, що характеризується злоякісними пухлинними клітинами, експресуючими CLDN18.2, який передбачає введення пацієнтові антитіла, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, в комбінованій терапії із засобом, який стимулює  Т-клітини, де (a) антитіло, яке зв'язує CLDN18.2 являє антитіло, здатне опосередкувати знищення клітин, експресуючих CLDN18.2 за допомогою антитілозалежної клітинноопосередкованої цитотоксичності (ADCC), опосередковуючої лізис, де антитіло включає важкий ланцюг антитіла, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NО:32 та легкий ланцюг антитіла, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NО:39; і (b) агент, стимулюючий  Т-клітини, являє собою бісфосфонат, і де бісфосфонат вводять пацієнтові в комбінованій терапії з інтерлейкіном-2. UA 115985 C2 (12) UA 115985 C2 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Раки шлунка й стравоходу (гастроезофагеальні раки; GE) належать до злоякісних новоутворень, з якими пов'язана найвища нереалізована потреба медицини. Рак шлунка посідає друге місце серед причин смерті від раку в усьому світі. Частота випадків виникнення езофагеального раку збільшилася за останні десятиліття, збігаючись зі зміною гістологічного типу й первинної локалізації пухлини. У цей час аденокарцинома стравоходу є більш поширеною в Сполучених штатах і Західній Європі, ніж плоскоклітинна карцинома, при цьому більшість пухлин знаходяться в дистальному стравоході. Рівень загального 5-літнього виживання для GE раку становить 20-25 %, незважаючи на агресивність установленого стандартного лікування, пов'язаного з істотними побічними ефектами. У більшості пацієнтів виявляється місцеворозташована або метастазуюча пухлина, після чого вони проходять першу серію хіміотерапії. Режими лікування, засновані на комбінації платини й похідних фторпіримідину, звичайно комбінують із третьою сполукою (наприклад, таксаном або антрациклінами). Однак, медіана виживання без прогресування від 5 до 7 місяців і медіана загального виживання від 9 до 11 місяців – це найкраще, чого можна чекати. Відсутність істотної користі від різних режимів комбінованої хіміотерапії нового покоління щодо цих видів раку стимулювала дослідження, пов'язані з використанням таргентних (націлених на мішень) препаратів. Останнім часом для лікування Her2/neu-позитивних гастроезофагеальних видів раку був схвалений трастузумаб. Однак, даний вид лікування придатний тільки для ~20 % пацієнтів, у яких експресується дана мішень, тому потреба медицини в препаратах залишається як і раніше високою. Молекула щільних контактів клаудин 18 сплайс-варіант 2 (клаудин 18.2 (CLDN18.2)) є членом родини білків клаудину – білків щільних контактів. CLDN18.2 є трансмембранним білком (27.8 кДа), який містить чотири трансмембранні домени із двома невеликими позаклітинними петлями. У нормальних тканинах, за винятком шлунка, відсутня експресія CLDN18.2, яку б можна було б зафіксувати за допомогою RT-PCR. Проведення імуногістохімічного аналізу за допомогою CLDN18.2-специфічних антитіл показує, що шлунок є єдиною позитивною за цим білком тканиною. CLDN18.2 є високоселективним гастральним антигеном, експресованим винятково на короткоживучих диференційованих епітеліальних клітинах шлунка. CLDN18.2 зберігається в ході злоякісної трансформації, і тому часто виявляється на поверхні клітин раку шлунка людини. Більше того, цей панпухлинний антиген ектопічно активований на значимих рівнях в аденокарциномах стравоходу, підшлункової залози й легенів. Білок CLDN18.2 також локалізується в метастазах аденокарциноми шлунка в лімфатичних вузлах і у віддалених метастазах, зокрема, у яєчниках (так звана пухлина Крукенберга). Химерне IgG1 антитіло IMAB362, спрямоване проти CLDN18.2, було розроблене компанією Ganymed Pharmaceuticals AG. IMAB362 розпізнає перший позаклітинний домен (ECD1) CLDN18.2 з високої афінністю й специфічністю. IMAB362 не зв'язується з будь-яким іншим членом родини клаудинів, включаючи близькоспоріднений сплайс-варіант 1 клаудину 18 (CLDN18.1). IMAB362 демонструє вузьку специфічність до пухлинних клітин і поєднує в собі чотири незалежні високоактивні механізми дії. Після зв'язування з мішенню IMAB362 опосередковує знищення клітин за допомогою ADCC, CDC та індукції апоптозу, спричиненого перехресним зв'язуванням мішені на поверхні пухлинної клітини, і прямого інгібування проліферації. Таким чином, IMAB362 ефективно викликає лізис CLDN18.2-позитивних клітин, включаючи лінію клітин раку шлунка людини in vitro і in vivo. У мишей, які несуть CLDN18.2позитивну лінію клітин раку, спостерігається позитивний вплив на виживання, і аж до 40 % мишей демонструє регресію пухлини при лікуванні IMAB362. Токсичність і PK/TK профіль IMAB362 були ретельно досліджені на мишах і яванських макаках (cynomolgus), включаючи визначення діапазону доз, 28-денне дослідження токсичності багаторазового застосування препарату на макаках і 3-місячне дослідження токсичності багаторазового застосування препарату на мишах. Було показано, що при внутрішньовенному уведенні (i.v.) багаторазові дози IMAB362 добре переносяться й мишами (сама більша тривалість щотижневого введення 3 місяці, найвищий рівень доз 400 мг/кг) і яванськими макаками (до 5 щотижневих застосувань аж до 100 мг/кг). Не виявлено ознак системної або місцевої токсичності. Зокрема, у жодному дослідженні токсичності не спостерігалося токсичної дії на шлунок. IMAB362 не викликає активації імунітету й вивільнення цитокінів. Не було відзначено негативних ефектів на репродуктивні органи самців або самок. IMAB362 не зв'язується із тканинами, які не мають мішені. Дослідження біорозподілення на мишах показало, що причиною відсутності гастральної токсичності найімовірніше є компартменталізація щільних контактів у місці просвіту в здоровому епітелії шлунка, яка, очевидно, значно зменшує 1 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доступність IMAB362 епітопа. Ця компартменталізація пропадає після злоякісної трансформації, що приводить епітоп у стан, який піддається впливу IMAB362. IMAB362 перебуває на ранній стадії клінічних випробувань. Фаза I клінічних випробувань 2 2 2 2 2 проводиться на людях. 5 дозових груп (33 мг/м , 100 мг/м , 300 мг/м , 600 мг/м , 1000 мг/м ) по 3 пацієнти в кожній одержували одне внутрішньовенне введення IMAB362, спостереження проводили протягом 28 днів. IMAB362 добре переносився, при цьому не проводилося відповідного дослідження безпеки для пацієнтів. В одного пацієнта всі вимірювані пухлинні маркери були значно знижені в межах 4 тижнів після лікування. Протягом IIa фази клінічних досліджень IMAB362 призначається повторно. Представлені в цьому документі дані показують, що бісфосфонати, такі як золедронова кислота (ZA), зокрема, при введенні в комбінації з рекомбінантним інтерлейкіном-2 (IL-2), збільшують активність анти-CLDN18.2 антитіла, такого як IMAB362. Основним механізмом є активація й розмноження високоцитотоксичної популяції імунних клітин (γ9δ2 Т-клітини). Крім того, ми представляємо результати, які демонструють, що хіміотерапевтичні засоби можуть стабілізувати або збільшувати експресію CLDN18.2 на поверхні ракових клітин, що приводить до підвищення доступності CLDN18.2 для анти-CLDN18.2 антитіла, такого як IMAB362. Спостерігалася синергійна дія анти-CLDN18.2 антитіла, такого як IMAB362, з певними хіміотерапевтичними режимами, зокрема, хіміотерапевтичними режимами, які використовуються при лікуванні раку шлунка або лікуванні солідних пухлин людини. Клітини раку людини, попередньо оброблені хіміотерапевтичними засобами, краще піддаються лізису, індукованому мішень-специфічним антитілом. На мишачих пухлинних моделях пригнічення пухлини з використанням анти-CLDN18.2 антитіла в комбінації з хіміотерапією перевершує застосування анти-CLDN18.2 антитіла у вигляді монотерапії. Розкриття винаходу Загалом, даний винахід надає комбіновану терапію для ефективного лікування й/або запобігання захворюванням, пов'язаним із клітинами, які експресують CLDN18.2, включаючи ракові захворювання, такі як рак шлунка, рак стравоходу, рак підшлункової залози, рак легенів, такий як недрібноклітинний рак легенів (NSCLC), рак яєчників, рак товстої кишки, рак печінки, рак голови й шиї, рак жовчного міхура та їх метастази, зокрема, метастази раку шлунка, такі як пухлина Крукенберга, метастази в очеревину й/або лімфатичні вузли. Зокрема, переважно раковими захворюваннями є аденокарциноми шлунка, стравоходу, протоки підшлункової залози, жовчовивідних шляхів, легенів і яєчників. В одному аспекті даний винахід пропонує спосіб лікування або запобігання ракового захворювання, який передбачає введення пацієнтові антитіла, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, у комбінації із засобом, який стимулює γδ Т-клітини. Засіб, який стимулює γδ Т-клітини, може бути введено до, одночасно з або після введення антитіла, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, або його комбінації. В одному варіанті здійснення γδ Т-клітини є Vγ9Vδ2 T клітинами. В одному варіанті здійснення засіб, який стимулює γδ Т-клітини, є бісфосфонатом, таким як азотовмісний бісфосфонат (амінобісфосфонат). В одному варіанті здійснення засіб, який стимулює γδ Тклітини, вибирають із групи, яка складається із золедронової кислоти, клодронової кислоти, ібандронової кислоти, памідронової кислоти, ризедронової кислоти, минодронової кислоти, олпадронової кислоти, алендронової кислоти, інкадронової кислоти та їх солей. В одному варіанті здійснення засіб, який стимулює γδ Т-клітини, уводять у комбінації з інтерлейкіном-2. В одному варіанті здійснення спосіб винаходу додатково включає введення засобу, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2. Експресія CLDN18.2 бажано відбувається на поверхні ракової клітини. Засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, може бути цитотоксичним і/або цитостатичним засобом. В одному варіанті здійснення засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, включає засіб, який викликає зупинку клітинного циклу або накопичення клітин в одній або більше фазах клітинного циклу, бажано в одній або більше фазах клітинного циклу, відмінних від G1-фази. Засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, може включати препарат, обраний із групи, яка складається з антрациклінів, сполук платини, аналогів нуклеозидів, таксанів і аналогів камптотецину або його проліків, та їх комбінацій. Засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, може включати препарат, обраний із групи, яка складається з епірубіцину, оксаліплатину, цисплатину, 5-фторурацилу або його проліків, таких як капецитабін, доцетаксел, іринотекан, та їх комбінацій. Засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, може включати комбінацію оксаліплатину й 5-фторурацилу або його проліків, комбінацію цисплатину й 5-фторурацилу або його проліків, комбінацію, щонайменше, одного антрацикліну й оксаліплатину, комбінацію, щонайменше, одного антрацикліну й 2 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цисплатину, комбінацію, щонайменше, одного антрацикліну й 5-фторурацилу або його проліків, комбінацію, щонайменше, одного таксану й оксаліплатину, комбінацію, щонайменше, одного таксану й цисплатину, комбінацію, щонайменше, одного таксану й 5-фторурацилу або його проліків, або комбінацію, щонайменше, одного аналога камптотецину й 5-фторурацилу або його проліків. Засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, може бути засобом, який викликає імуногенну загибель клітин. Засіб, який викликає імуногенну загибель клітин, може включати засіб, обраний із групи, яка складається з антрациклінів, оксаліплатину та їх комбінацій. Засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, може включати комбінацію епірубіцину й оксаліплатину. В одному варіанті здійснення спосіб запропонований винаходом передбачає введення, щонайменше, одного антрацикліну, щонайменше, однієї сполуки платини й, щонайменше, одного 5-фторурацилу і його проліків. Антрациклін можна вибрати із групи, яка складається з епірубіцину, доксорубіцину, даунорубіцину, ідарубіцину й валрубіцину. Бажано, антрациклін є епірубіцином. Сполуку платини можна вибрати із групи, яка складається з оксаліплатину й цисплатину. Нуклеозидний аналог може бути обраний із групи, яка складається з 5-фторурацилу і його проліків. Таксан можна вибрати із групи, яка складається з доцетакселу й паклітакселу. Аналог камптотецину може бути обраний із групи, яка складається з іринотекану й топотекану. В одному варіанті здійснення спосіб запропонований винаходом передбачає введення (i) епірубіцину, оксаліплатину й 5-фторурацилу, (ii) епірубіцину, оксаліплатину й капецитабіну, (iii) епірубіцину, цисплатину й 5-фторурацилу, (iv) епірубіцину, цисплатину й капецитабіну, або (v) фолінієвої кислоти, оксаліплатину й 5-фторурацилу. Спосіб винаходу може додатково включати введення, щонайменше, одного додаткового хіміотерапевтичного засобу, який може бути цитотоксичним засобом. Антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, може зв'язуватися з нативними епітопами CLDN18.2, присутніми на поверхні живих клітин. В одному варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, зв'язується з першою позаклітинною петлею CLDN18.2. В одному варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, опосередковує знищення клітини за допомогою одного або більше з поміж опосередкованого комплементзалежною цитотоксичністю (CDC) лізису, опосередкованого антитілозалежною клітинноопосредкованою цитотоксичністю (ADCC) лізису, індукції апоптозу й інгібування проліферації. В одному варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, є моноклональним, химерним або гуманізованим антитілом або фрагментом антитіла. В одному варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, є антитілом, обраним із групи, яка складається з (i) антитіла, продукованого й/або отриманого від клону, депонованого під обліковим номером DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 або DSM ACC2810, (ii) антитіла, яке є химерною або гуманізованою формою антитіла згідно (i), (iii) антитіла, яке проявляє специфічність антитіла згідно (i) і (iv) антитіла, яке містить антигензв'язуючу ділянку або антигензв'язуючий сайт, зокрема, варіабельну область, антитіла згідно (i) антитіла, яке бажано проявляє специфічність, згідно (i). В одному варіанті здійснення антитіло з'єднане з терапевтичним засобом, таким як токсин, радіоізотоп, лікарський засіб або цитотоксичний засіб. В одному варіанті здійснення спосіб запропонований винаходом передбачає введення 2 антитіла, яке проявляє здатність зв'язуватись з CLDN18.2, у дозі аж до 1000 мг/м . В одному варіанті здійснення спосіб запропонований винаходом передбачає введення антитіла, яке 2 проявляє здатність зв'язуватись з CLDN18.2, повторно в дозі від 300 до 600 мг/м . В одному варіанті здійснення рак є CLDN18.2-позитивним. В одному варіанті здійснення ракове захворювання вибирають із групи, яка складається з раку шлунка, раку стравоходу, раку підшлункової залози, раку легенів, раку яєчників, раку товстої кишки, раку печінки, раку голови й шиї, раку жовчного міхура та їх метастазів. Ракове захворювання може бути пухлиною Крукенберга, метастазами в очеревину й/або лімфатичні вузли. В одному варіанті здійснення рак є аденокарциномою, зокрема аденокарциномою, що прогресує. В одному варіанті здійснення рак вибирають із групи, яка складається з раку шлунка, раку стравоходу, зокрема, нижнього відділу стравоходу, раку гастроезофагіального з'єднання й гастроезофагіального раку. Пацієнт може бути пацієнтом з негативним статусом за HER2/neu або пацієнтом з позитивним статусом за HER2/neu, але таким, для якого лікування трастузумабом не придатне. Згідно з винаходом, CLDN18.2 бажано має амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 1. У додатковому аспекті даний винахід пропонує медичний препарат, який містить антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, і засіб, який стимулює γδ Т-клітини. Медичний 3 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 препарат даного винаходу може додатково включати засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2. Антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, і засіб, який стимулює γδ Т-клітини, і необов'язковий засіб, який стабілізує і який збільшує експресію CLDN18.2, можуть бути присутніми у медичному препараті у вигляді суміші або окремо один від одного. Медичний препарат може бути набором, який включає перший контейнер, який містить антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватись з CLDN18.2 і контейнер, який містить засіб, який стимулює γδ Т-клітини, і необов'язково контейнер, який містить засіб, який стабілізує і збільшує експресію CLDN18.2. Медичний препарат може додатково включати друковані інструкції із застосування препарату для лікування раку, зокрема, для застосування препарату згідно способу запропонованого винаходом. Різними варіантами втілення медичного препарату й, зокрема, засобу, який стимулює γδ Т-клітини, і засобу, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, є описані вище відносно способу винаходу. Даний винахід також пропонує описані тут засоби, такі як антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватись з CLDN18.2, для застосування в описаних тут способах, наприклад, для введення в комбінації із засобом, який стимулює γδ Т-клітини, і необов'язково засобом, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2. Інші ознаки й переваги даного винаходу стануть зрозумілими з наступного докладного опису й пунктів формули винаходу. Короткий опис креслень Фігура 1. Дія хіміотерапії на клітини раку шлунка. Культивування клітин KatoIII протягом 96 годин приводить до зупинки клітинного циклу в G0/G1-фазі й негативної регуляції CLDN18.2. Цитостатичні сполуки, які викликають зупинку клітинного циклу в різних фазах клітинного циклу (S-фаза(5-FU) або G2-фаза (епірубіцин)), стабілізують CLDN18.2-експресію. Фігура 2. Дія хіміотерапії на клітини раку шлунка. a/b: Дія хіміотерапії на рівні транскрипта й білка CLDN18.2 у клітинах раку шлунка. c: Результати дослідження за допомогою проточної цитометрії позаклітинного зв'язування IMAB362 на клітинах раку шлунка, оброблених хіміотерапевтичними засобами. Фігура 3. Дія хіміотерапії на клітини раку шлунка. Цитостатична сполука, яка викликає зупинку клітинного циклу в різних фазах клітинного циклу (S/G 2-фаза (іринотекан) або G2-фаза (доцетаксел)). Фігура 4. IMAB 362-індукований ADCC опосередковує знищення клітин раку шлунка після попередньої обробки хіміотерапевтичними засобами. Фігура 5. Дія хіміотерапії на клітини раку шлунка. a: Клітини, оброблені іринотеканом, доцетакселем або цисплатином демонструють більш низький рівень життєздатних клітин у порівнянні із клітинами, культивованими в середовищі. b: CLDN18.2 експресія в клітинах, оброблених іринотеканом, доцетакселем або цисплатином, є підвищеною в порівнянні із клітинами, культивованими в середовищі. c/d: Обробка клітин іринотеканом, доцетакселем або цисплатином збільшує потенційну можливість IMAB362 викликати ADCC. Фігура 6. Ефекти хіміотерапії на CDC, індукований IMAB362. Фігура 7. Ефекти хіміотерапії на ефекторні клітини. Фігура 8. Розмноження PBMC у культурах з додаванням ZA/IL-2. Фігура 9. Збагачення Vγ9Vδ2 Т-клітин в PBMC культурах з додаванням ZA/IL-2. Фігура 10. Збагачення Vγ9Vδ2 Т-клітин у середовищі з додаванням ZA і зростаючої дози IL2. Фігура 11. Розмноження й цитотоксична активність Vγ9Vδ2 Т-клітин після спільної інкубації з ZА-активованими моноцитами й клітинами раку людини. Фігура 12. ZА-залежний розвиток різних типів клітин в PВМС-культурах. Фігура 13. Поверхневі маркери на Vγ9Vδ2 Т-клітинах після ZA/IL-2 обробки. Фігура 14. ADCC активність Vγ9Vδ2 Т-клітин у комбінації з IMAB362 на CLDN18.2-позитивних NUGC-4 клітинах раку шлунка. Фігура 15. ADCC активність IMAB362 з використанням Vγ9Vδ2 Т-клітин як ефекторних клітин. Фігура 16. Дія ZA на поверхневе розташування CLDN18.2 на клітинах-мішенях. Фігура 17. Ефекти хіміотерапії й ZA/IL-2- обробки на ефекторні клітини. Фігура 18. Дослідження біорозподілення кон'югованих антитіл у мишей. Фігура 19. Раннє лікування HEK293~CLDN18.2 ксенотрансплантатів пухлини. Фігура 20. Лікування розвинених HEK293~CLDN18.2 ксенотрансплантатів пухлини. Фігура 21. Дія IMAB362 на ріст підшкірних ксенотрансплантатів раку шлунка. Фігура 22. Ефекти імунотерапії IMAB362 на NCI-N87~CLDN18.2 ксенотрансплантати карциноми шлунка. 4 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 23. Ефекти комбінованої терапії IMAB362 і режиму EOF на NCI-N87~CLDN18.2 ксенотрансплантати. Фігура 24. Ефекти комбінованої терапії IMAB362 і EOF режиму на NUGC-4~CLDN18.2 ксенотрансплантати. Фігура 25. Дія ZA/IL-2-індукованих Vγ9Vδ2 Т-клітин на контроль макроскопічних пухлин з використанням IMAB362 у мишей NSG. Фігура 26. Ефекти комбінованої терапії IMAB362 і EOF режиму на CLS-103~cldn18.2 алотрансплантати пухлин. Докладний опис винаходу Незважаючи на те, що даний винахід докладно описаний далі, зрозуміло, що цей винахід не обмежується конкретними методиками, протоколами й реагентами, описаними тут, оскільки вони можуть відрізнятися. Також слід розуміти, що використана в описі термінологія призначена тільки для опису окремих варіантів здійснення й не покликана обмежувати обсяг даного винаходу, який буде обмежуватися тільки прикладеними пунктами формули винаходу. Якщо не зазначено інакшого, усі технічні й наукові терміни, використані в описі, мають ті ж самі значення, які звичайно зрозумілі пересічному фахівцеві у даній галузі техніки. Надалі будуть описані елементи даного винаходу. Ці елементи перелічуються в конкретних варіантах здійснення, однак, повинно бути зрозумілим, що вони можуть поєднуватися будь-яким чином і в будь-якій кількості для створення додаткових варіантів здійснення. Описані різним чином приклади й кращі варіанти здійснення не повинні тлумачитися як такі, що обмежують даний винахід тільки точно описаними варіантами здійснення. Слід розуміти, що цей опис підтримує й розглядає варіанти здійснення, які поєднують точно описані варіанти здійснення з будь-яким числом розкритих і/або кращих елементів. Більше того, будь-які перестановки й комбінації всіх описаних елементів у цій заявці слід розглядати як розкриті описом даної заявки, якщо контекст не диктує іншого. Бажано, використані в описі терміни визначаються так, як описано в "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, і H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995). При здійсненні даного винаходу використовуються, якщо не зазначене інакше, звичайні методи хімії, біохімії, клітинній біології, імунології й методи рекомбінантних ДНК, які пояснюються в літературі, присвяченій даної галузі техніки (дивися, наприклад, Molecular nd Cloning: A Laboratory Manual, 2 Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989). Протягом цього докладного опису й наступних пунктів формули винаходу, якщо контекст не вимагає іншого, слід розуміти, що слово "містити" і його варіанти, такі як "містить" і "який утримує", припускає включення певного члена, цілого числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій, а не виключення будь-якого іншого члена, цілого числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій, хоча в деяких варіантах здійснення такий інший член, ціле число або стадія або група членів, цілих чисел або стадій може виключатися, тобто об'єкт винаходу полягає у включенні встановленого члена, цілого числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій. Терміни "a" і "an" і "the" і подібні посилання, використані в контексті опису винаходи (особливо в контексті формули винаходу) слід тлумачити, як такі, що включають і однину й множину, якщо в описі не зазначено іншого або інше явно не продиктоване контекстом. Перерахування меж значень в описі служить тільки як спосіб скорочення згадування окремо кожного окремого значення, що попадає в межі. Якщо не зазначене інше, кожне конкретне значення включається до докладного опису, як ніби воно було окремо перераховане в описі. Усі описані тут методи можуть здійснюватися в будь-якому придатному порядку, якщо в описі не зазначене інше або іншим способом явно не суперечить контексту. Використання всіх без винятку прикладів або характерних виразів (наприклад, "такий як"), наданих в описі, вживається тільки з метою кращої ілюстрації винаходу й не обмежує рамки винаходу, заявлені в іншій формі. Формулювання докладного опису не повинні бути витлумачені, як такі, що означають який-небудь незаявлений елемент, істотний для здійснення винаходу на практиці. Протягом тексту даної заявки процитовано кілька документів. Кожний з наведених в описі документів (включаючи всі патенти, патентні заявки, наукові публікації, специфікації виробника, інструкції тощо), чи то вище або нижче за текстом, повністю включаються до опису як посилання. Ніщо в описі не слід розглядати як допущення, що винахід не має права датувати таке розкриття відповідно до попереднього винаходу. Термін "CLDN18" відноситься до клаудину 18 і включає будь-які варіанти, включаючи клаудин 18 сплайс-варіант 1 (клаудин 18.1 (CLDN18.1)) і клаудин 18 сплайс-варіант 2 (клаудин 18.2 (CLDN18.2)). 5 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "CLDN18.2" переважно має відношення до людського CLDN18.2 і, зокрема, до білка, який містить, бажано складається з амінокислотної послідовності відповідно до SEQ ID NO: 1 зі списку послідовностей або варіанта зазначеної амінокислотної послідовності. Термін "CLDN18.1" переважно має відношення до людського CLDN18.1 і, зокрема, до білка, що містить, бажано складається з амінокислотної послідовності відповідно до SEQ ID NO: 2 зі списку послідовностей або варіанта зазначеної амінокислотної послідовності. Термін "варіант" згідно з винаходом має відношення, зокрема, до мутантів, сплайс-варіантів, ізоформ, алельних варіантів, видових варіантів і видових гомологів, зокрема, наявних у природі. Алельний варіант має відношення до зміни в нормальній послідовності гена, значення якого часто є незрозумілим. Повне генетичне секвенування часто встановлює численні алельні варіанти для даного гена. Видовим гомологом є послідовність нуклеїнових кислот або амінокислот, джерелом походження яких є інший вид, що відрізняється від виду походження даної послідовності нуклеїнових кислот або амінокислот. Термін "варіант" буде включати будьякі посттрансляційно модифіковані варіанти й конформаційні варіанти. Згідно з винаходом термін "CLDN18.2-позитивний рак" означає рак за участю ракових клітин, які експресують CLDN18.2, бажано на поверхні зазначених ракових клітин. Термін "поверхня клітини" використовується відповідно до його звичайного значення в даній галузі, і в такий спосіб передбачає зовнішню поверхню клітини, доступну для зв'язування з білками й іншими молекулами. CLDN18.2 експресується на поверхні клітин у тому випадку, якщо він розташовується на поверхні зазначених клітин, і є доступним для зв'язування CLDN18.2-специфічними антитілами при додаванні їх до клітин. Згідно з винаходом, вважають, що CLDN18.2 незначно експресується у клітині, якщо рівень експресії є більш низьким у порівнянні з експресією в клітинах шлунка або тканині шлунка. Бажано, рівень експресії становить менше, ніж 10 %, бажано менше ніж 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % або 0,05 % експресії в клітинах шлунка або тканині шлунка або навіть нижче. Переважно, вважають, що CLDN18.2 незначно експресується у клітині, якщо рівень експресії перевищує рівень експресії в нераковій тканині, відмінній від тканини шлунка, не більше, ніж в 2 рази, бажано в 1, 5 рази, і бажано не перевищує рівень експресії в зазначеній нераковій тканині. Переважно, вважають, що CLDN18.2 незначно експресується у клітині, якщо рівень експресії нижче межі виявлення, і/або якщо рівень експресії є занадто низьким, щоб забезпечити можливість зв'язування CLDN18.2- специфічними антитілами при додаванні їх до клітин. Згідно з винаходом CLDN18.2 експресується в клітині, якщо рівень експресії перевищує рівень експресії в нераковій тканині, відмінній від тканини шлунка, бажано більше, ніж в 2 рази, краще в 10 разів, в 100 разів, в 1000 разів або в 10000 разів. Переважно, CLDN18.2 експресується в клітині, якщо рівень експресії вище межі виявлення, і/або якщо рівень експресії є досить високим, щоб забезпечити можливість зв'язування CLDN18.2-специфічними антитілами при додаванні їх до клітин. Бажано, експресований у клітині CLDN18.2 експресується або експонується на поверхні зазначеної клітини. Згідно з винаходом термін "хвороба" відноситься до будь-якого патологічного стану, включаючи рак, зокрема, до описаних у даному документі форм раку. Будь-які згадування раку або конкретних форм раку в даному документі також включають його метастази. У кращому варіанті здійснення хвороба, яку необхідно лікувати відповідно до даної заявки, стосується клітин, які експресують CLDN18.2. "Хвороби, пов'язані із клітинами, які експресують CLDN18.2," або подібні вирази означають згідно з винаходом, що CLDN18.2 експресується в клітинах хворої тканини або органа. В одному варіанті здійснення експресія CLDN18.2 у клітинах хворої тканини або органа є підвищеною в порівнянні зі станом у здоровій тканині або органі. Під підвищенням слід розуміти підвищення, щонайменше, на 10 %, зокрема, щонайменше, на 20 %, щонайменше, на 50 %, щонайменше, на 100 %, щонайменше, на 200 %, щонайменше, на 500 %, щонайменше, на 1000 %, щонайменше, на 10 000 % або навіть більше. В одному варіанті здійснення експресія виявлена тільки у хворій тканині, тоді як експресія в здоровій тканині пригнічена. Згідно з винаходом, хвороби, пов'язані із клітинами, які експресують CLDN18.2, включають ракові захворювання. Крім того, згідно з винаходом раковими захворюваннями переважно є ті, у яких ракові клітини експресують CLDN18.2. При використанні в описі термін "ракова хвороба" або "рак" включає хворобу, яка характеризується неправильно регульованим клітинним ростом, проліферацією, диференціюванням, адгезією й/або міграцією. Під " раковою клітиною" слід розуміти аномальну клітину, яка росте за допомогою швидкої, неконтрольованої клітинної проліферації й продовжує рости після стимулу (впливу), що ініціює припинення нового росту. Бажано "ракова хвороба" 6 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 характеризується клітинами, які експресують CLDN18.2, а ракова клітина експресує CLDN18.2. Клітина, яка експресує CLDN18.2, переважно є раковою клітиною, переважно описаних тут видів раку. "Аденокарцинома" є раком, що виникає в залозистій тканині. Ця тканина до того ж є частиною великої групи тканин, відомих як епітеліальна тканина. Епітеліальна тканина включає шкіру, залози й цілий ряд інших тканин, що вистилають порожнини й органи тіла. З погляду ембріології епітелій походить із ектодерми, ендодерми й мезодерми. Щоб відноситися до аденокарциноми, клітини необов'язково повинні бути частиною залози, за умови, що вони мають секреторні властивості. Ця форма карциноми може виникати в деяких вищих тварин, включаючи людей. Добре диференційовані аденокарциноми мають тенденцію бути подібними до залозистої тканини, з якої вони походять, у той час як погано диференційовані можуть не бути подібними до залозистої тканини. За допомогою фарбування клітин, отриманих з біопсійного матеріалу, патолог визначає, чи є пухлина аденокарциномою або іншим типом раку. Аденокарциноми можуть виникати в багатьох тканинах організму внаслідок широкого поширення залоз в організмі. Поряд з тим, що кожна залоза не може секретувати ту саму речовину, коли в клітини існує зовнішньосекреторна функція, вона вважається залозистою, і тому її злоякісна форма називається аденокарциномою. Злоякісні аденокарциноми вторгаються в інші тканини й дають метастази, які також проникають в інші тканини. Аденокарцинома яєчника є найпоширенішим типом карциноми яєчника. Сюди включаються серозні й слизові аденокарциноми, світлоклітинна аденокарцинома й ендометриоїдна аденокарцинома. Під "метастазуванням" розуміють поширення ракових клітин з первинного місця розташування в іншу частину організму. Утворення метастаз є дуже складним процесом і залежить від відділення злоякісних клітин від первинної пухлини, вторгнення (інвазії) у позаклітинний матрикс, проникання в ендотеліальні базальні мембрани для проникнення в порожнину тіла й судин, а потім, після транспортування кровотоком, інфільтрації в органімішені. Нарешті, ріст нової пухлини в місці-мішені залежить від ангіогенезу. Метастази пухлини можуть виникати навіть після видалення первинної пухлини, тому що пухлинні клітини або компоненти можуть залишитися й розвити метастатичний потенціал. В одному варіанті здійснення термін "метастаза" згідно з винаходом має відношення до "віддаленої метастази", тобто метастази, вилученої від первинної пухлини й системи регіональних лімфатичних вузлів. В одному варіанті здійснення термін "метастаза" згідно з винаходом відноситься до метастаз в лімфатичному вузлі. Однієї конкретною формою метастаз, яка піддається лікуванню за допомогою терапії запропонованої винаходом, є метастаза, яка бере початок від раку шлунка як первинного вогнища. У кращих варіантах здійснення така метастаза раку шлунка є пухлиною Крукенберга, метастазами в очеревину й/або метастазами в лімфатичні вузли. Пухлина Крукенберга є рідкісною метастатичною пухлиною яєчника, яка охоплює від 1 % до 2 % від усіх пухлин яєчника. Прогноз пухлини Крукенберга залишається поганим, при цьому не існує загальноприйнятого лікування для пухлини Крукенберга. Пухлина Крукенберга є метастатичною перстневидноклітинною аденокарциномою яєчника. Шлунок є первинним вогнищем для більшості випадків пухлини Крукенберга (70 %). Наступними за поширеністю первинними локалізаціями є карциноми товстої кишки, апендикса й молочної залози (в основному інвазивна долькова карцинома). Повідомлялося про одиничні випадки пухлини Крукенберга, які походять з карциноми жовчного міхура, жовчних проток, підшлункової залози, тонкого кишечнику, Фатерова сосочка, шийки матки й сечового міхура/сечової протоки. Інтервал між постановкою діагнозу первинної карциноми й наступним виявленням ураження яєчника становить звичайно 6 місяців або менше, однак повідомлялося й про більш тривалі строки. У багатьох випадках, первинна пухлина є дуже маленькою й може залишитися непоміченою. Попередня карцинома шлунка або іншого органа в анамнезі спостерігається тільки в 20-30 % випадків. Пухлина Крукенберга являє приклад селективного поширення раку, найчастіше в напрямку шлунок – яєчник. Ця "вісь" поширення пухлини історично привертає увагу багатьох патоморфологів, зокрема, коли було виявлено, що новоутворення в шлунку селективно метастазують у яєчники, не уражаючи інших тканин. Шлях метастазів карциноми шлунка в яєчники був загадкою протягом тривалого часу, однак тепер очевидно, що ретроградне поширення лімфатичними судинами є найбільш імовірним шляхом метастазування. Пухлини Крукенберга з'являються в молодих жінок, що є незвичайним для пацієнтів з метастатичною карциномою, яка спостерігається в більшості випадків на п'ятому десятку життя, із середнім віком 45 років. Цей ранній вік поширення може бути почасти пов'язаний з підвищеною частотою випадків перстневидноклітинної карциноми шлунка в молодих жінок. симптоми, які при цьому часто зустрічаються, як правило, пов'язані із залученням у процес 7 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яєчників, найпоширенішими з яких є біль у животі й здуття живота (в основному внаслідок двосторонньої великої маси яєчників). В іншої частини пацієнтів спостерігаються неспецифічні шлунково-кишкові симптоми або симптоми відсутні. На додачу до цього, пухлина Крукенберга за наявним даними пов'язана з маскулінізацією, що є результатом виділення гормонів стромою яєчників. В 50 % випадків у пацієнтів є асцит, що звичайно містить злоякісні клітини. Пухлина Крукенберга є двосторонньою більше ніж в 80 % відомих випадків. Як правило, яєчники збільшені асиметрично й мають горбистий контур. Поверхні зрізів жовтого або білого кольору; звичайно це солідні пухлини, хоча іноді бувають кистовидними. Важливо, щ поверхня капсули яєчників з пухлиною Крукенберга в більшості випадків є гладкою й не має спайок або очеревинних відкладань. Слід зазначити, що інші метастатичні пухлини в яєчнику, як правило, пов'язані з поверхневими імплантатами. Це може пояснювати, чому макроскопічне патоморфологічне дослідження пухлини Крукенберга може давати хибне враження первинної пухлини яєчника. Однак, двостороння симетрія пухлини Крукенберга відповідає його метастатичній природі. Слід зазначити високий відсоток загальної летальності серед пацієнтів з пухлиною Крукенберга. Більшість пацієнтів умирає протягом 2 років (медіана виживання 14 місяців). Деяка кількість досліджень показує, що прогноз є поганим, у тому випадку, коли первинна пухлина встановлена після виявлення метастазів у яєчниках, при цьому прогноз стає ще гіршим, якщо первинна пухлина залишається невиявленою. У літературі оптимальна стратегія лікування пухлини Крукенберга чітко не встановлена. Питання здійснення хірургічного видалення недостатньо врегульоване. Хіміотерапія або радіотерапія не має значної дії на прогноз пацієнтів з пухлиною Крукенберга. Під терміном "лікувати" слід розуміти введення суб'єктові сполуки або композиції або комбінації сполук або композицій з метою запобігання або усунення хвороби, включаючи зменшення розмірів пухлини або кількості пухлин у суб'єкта; затримку або уповільнення хвороби в суб'єкта; інгібування або уповільнення розвитку нової хвороби в суб'єкта; зменшення частоти й тяжкості симптомів і/або рецидивів у суб'єкта, що має в цей час або, який раніше мав захворювання; і/або подовження, тобто збільшення тривалості життя суб'єкта. Зокрема, термін "лікування хвороби" включає лікування, зменшення тривалості, полегшення, запобігання, уповільнення або інгібування прогресу або погіршення, або запобігання або затримку початку хвороби або її симптомів. Згідно з винаходом термін "пацієнт" позначає суб'єкта, який потребує лікування, зокрема, хворого суб'єкта, включаючи людей, нелюдиноподібних приматів або інших тварин, зокрема, ссавців, таких як корови, коні, свині, вівці, кози, собаки, кішки, або гризунів, таких як миші й пацюки. В найкращому варіанті здійснення пацієнт є людиною. γδ Т-клітини (гама дельта Т-клітини) представляють невелику підгрупу Т-клітин, які мають різні Т-клітинні рецептори (TCR) на поверхні. Більшість Т-клітин мають TCR, які складаються із двох ланцюгів глікопротеїнів, які називаються α- і β-TCR ланцюги. На противагу до цього, в γδ Тклітин TCR складається з одного γ-ланцюга й одного δ-ланцюга. Ця група Т-клітин ще менше поширена, ніж αβ Т-клітини. У людини γδ T клітини відіграють важливу роль у відповідях, пов'язаних з наглядом за стресами, подібними до інфекційних хвороб і аутоімунних реакцій. Крім того, уважається, що індуковані трансформацією зміни в пухлинах викликають відповіді, пов'язані з наглядом за стресом, які опосередковані γδ Т-клітинами, і збільшують протипухлинний імунітет. Важливо відзначити, що після захоплення антигену активовані γδ Тклітини в місцях ушкоджень забезпечують цитокіни (наприклад, INFγ, TNFα) і/або хемокіни, які опосередковують залучення інших ефекторних клітин, і демонструють безпосередні ефекторні функції, такі як цитотоксичність (за допомогою рецепторів клітинної смерті й цитолітичних гранул) і ADCC. Більша частина γδ Т-клітин у периферійній крові експресує Vγ9Vδ2 Т-клітинний рецептор (TCRγδ). Vγ9Vδ2 Т-клітини характерні тільки для людей і приматів і, як вважається, відіграють попереджувальну й істотну роль у відчутті "небезпеки" у відношенні інвазивних патогенів, оскільки їх кількість різко збільшується при багатьох гострих інфекціях і може перевищувати кількість усіх інших лімфоцитів у межах декількох днів, наприклад, при туберкульозі, сальмонельозі, ерліхіозі, бруцельозі, туляремії, лістеріозі, токсоплазмозі й малярії. γδ Т-клітини реагують на невеликі непептидні фосфорильовані антигени (фосфоантигени), такі як пірофосфати, синтезовані бактеріями, і ізопентеніл пірофосфат (IPP), продукований клітинами ссавців за допомогою мевалонатного шляху. Тоді як вироблення IPP у нормальних клітинах є недостатнім для активації γδ Т-клітин, дисрегуляція мевалонатного шляху в пухлинних клітинах призводить до накопичення IPP і активації γδ Т-клітин. IPP також може бути терапевтично підвищеним за допомогою амінобісфосфонатів, які інгібують фермент 8 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мевалонатного шляху фарнезил пірофосфат синтази (FPPS). Серед інших, такого роду амінобісфосфонатом є золедронова кислота (ZA, золедронат, Zometatm, Novartis), яка уже вводиться пацієнтам у клініці для лікування остеопорозу й метастатичного захворювання кісток. Після обробки PBMCs in vitro, ZA поглинається винятково моноцитами. IPP накопичується в моноцитах, і вони видозмінюються в антиген-презентуючі клітини, які стимулюють розвиток γδ Т-клітин. У даному контексті кращим є додавання інтерлейкіну-2 (IL-2) як фактора росту й виживання для активованих γδ Т-клітин. І нарешті, повідомлялося, що деякі алкильовані аміни активують Vγ9Vδ2 Т-клітини in vitro, однак, тільки в мілімолярних концентраціях. Згідно з винаходом термін "засіб, який стимулює γδ Т-клітини, " має відношення до сполук, які стимулюють розвиток γδ Т-клітин, зокрема, Vγ9Vδ2 Т-клітин, in vitro і/або in vivo, зокрема шляхом індукції активації й розмноження γδ Т-клітин. Бажано, термін має відношення до сполук, які збільшують, in vitro і/або in vivo, вироблення ізопентеніл пірофосфату (IPP) у клітинах ссавців, переважно шляхом інгібування ферменту мевалонатного шляху фарнезил пірофосфат синтази (FPPS). Однієї окремою групою сполук, які стимулюють γδ Т-клітини, є бісфосфонати, зокрема азотовмісні бісфосфонати (N-бісфосфонати; амінобісфосфонати). Наприклад, придатні для використання у винаході бісфосфонати можуть включати одну або більше з поміж наступних сполук, включаючи їх аналоги й похідні, фармацевтичні солі, гідрати, складні ефіри, кон'югати й проліки: [1-гідрокси-2-(1Н-імидазол-1-іл)етан-1,1-диіл]біс (фосфонова кислота), золедронова кислота, наприклад, золедронат; (дихлор-фосфоно-метил) фосфонова кислота, наприклад, клодронат {1-гідрокси-3-[метил(пентил)аміно]пропан-1,1-диіл}біс (фосфонова кислота), ібандронова кислота, наприклад, ібандронат (3-аміно-1-гідроксипропан-1,1-диіл)біс(фосфонова кислота), памідронова кислота, наприклад, памідронат; (1-гідрокси-1-фосфоно-2-піридин-3-іл-етил) фосфонова кислота, ризедронова кислота, наприклад, ризедронат; (1-гідрокси-2-імідазо[1,2-a]піридин-3-іл-1-фосфоноетил) фосфонова кислота, мінодронова кислота; [3-(диметиламіно)-1-гідроксипропан-1,1-диіл]біс (фосфонова кислота), олпадронова кислота. [4-аміно-1-гідрокси-1-(гідрокси-оксидо-фосфорил)-бутил] фосфонова кислота, алендронова кислота, наприклад, алендронат; [(Циклогептиламіно)метилен]біс(фосфонова кислота), інкадронова кислота; (1-гідроксиетан-1,1-диіл)біс(фосфонова кислота), етидронова кислота, наприклад, етидронат; і {[4-хлорфеніл)тіо]метилен}біс(фосфонова кислота), тилудронова кислота. Згідно з винаходом, золедронова кислота (INN) або золедронат (який продається компанією Novartis під торговими марками Zometa, Zomera, Aclasta і Reclast) є особливо бажаним бісфосфонатом. Zometa використовується для запобігання переломів костей скелету в пацієнтів з такими видами раку, як множинна мієлома й рак передміхурової залози, а також для лікування остеопорозу. Препарат також використовується для лікування гіперкальціємії при злоякісних новоутвореннях і може бути корисним при лікуванні болі, яка є результатом кісткових метастазів. В одному з кращих варіантів здійснення, засіб, який стимулює γδ Т-клітини, згідно з винаходом уводять у комбінації з IL-2. Показано, що така комбінація, зокрема, є ефективною при опосередкуванні розмноження й активації γ9δ2 Т-клітин. Інтерлейкін-2 (IL-2) - це інтерлейкін, тип цитокіна - сигнальної молекули в імунній системі. Це білок, який "притягає" лімфоцити і є частиною природної імунної відповіді на мікробну інфекцію, і відіграє роль при проведенні розрізнення між "чужим" ("не своїм") і "своїм". IL-2 опосередковує свої ефекти шляхом зв'язування з IL-2 рецепторами, які експресуються лімфоцитами. IL-2, який використовується у винаході, може бути будь-яким IL-2, який сприяє або забезпечує можливість стимулювання γδ Т-клітин, і може походити від будь-яких видів, бажано, від людини. IL-2 може бути ізольованим, отриманим рекомбінантним шляхом або синтетичним IL-2, може бути інтерлейкіном природного походження або модифікованим IL-2. Термін "засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2," відноситься до засобу або комбінації засобів, забезпечення наявності яких у клітинах приводить до підвищення рівнів РНК і/або білка CLDN18.2, бажано підвищення рівнів білка CLDN18.2 на клітинній поверхні, у порівнянні з умовами, коли клітини не забезпечуються даним засобом або комбінацією засобів. Переважно, клітина є раковою клітиною, зокрема, раковою клітиною, яка експресує CLDN18.2, 9 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такою як клітини описаних тут видів раку. Термін "засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2," відноситься, зокрема, до засобу або комбінації засобів, забезпечення наявності яких у клітинах приводить до більш високої щільності CLDN18.2 на поверхні зазначених клітин у порівнянні з умовами, коли клітини не забезпечуються даним засобом або комбінацією засобів. "Стабілізація експресії CLDN18.2" включає, зокрема, ситуацію, коли даний засіб або комбінація засобів запобігає зниженню або зменшує зниження експресії CLDN18.2, наприклад, експресія CLDN18.2 могла б знижуватися без забезпечення наявності засобу або комбінації засобів, а забезпечення наявності засобу або комбінації засобів запобігає зазначеному зниженню або зменшує зниження CLDN18.2 експресії. "Збільшення експресії CLDN18.2" включає, зокрема, ситуацію, коли даний засіб або комбінація засобів збільшує експресію CLDN18.2, наприклад, експресія CLDN18.2 могла б знижуватися, залишатися в основному постійною або збільшуватися без забезпечення наявності засобу або комбінації засобів, а забезпечення наявності засобу або комбінації засобів збільшує CLDN18.2 експресію в порівнянні з умовами без забезпечення наявності засобу або комбінації засобів, так що одержана в результаті експресія є більш високою в порівнянні із ситуацією, за якої експресія CLDN18.2 могла знижуватися, залишатися в основному постійною або збільшуватися без забезпечення наявності засобу або комбінації засобів. Згідно з винаходом термін "засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2," включає хіміотерапевтичні засоби або комбінації хіміотерапевтичних засобів, таких як цитостатичні засоби. Хіміотерапевтичні засоби можуть впливати на клітини одним з наступних способів: (1) можуть пошкоджувати ДНК клітин, так що вони не здатні більше відтворюватися, (2) інгібувати синтез нових ниток ДНК, так що стає неможливою клітинна реплікація, (3) зупиняти мітотичні процеси в клітинах, так що клітини не можуть ділитися на дві клітини. Згідно з винаходом термін "засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2," переважно відноситься до засобу або комбінації засобів, таких як цитостатичні сполуки або комбінація цитостатичних сполук, забезпечення наявності яких у клітинах, зокрема, ракових клітинах, призводить до зупинки або накопичення клітин в одній або більше фазах клітинного циклу, бажано в одній або більше фазах клітинного циклу, відмінних від G1- і G0-фаз, бажано відмінних від G1-фази, бажано в одній або більше з поміж G2- або S-фази клітинного циклу, такої як G1/G2-, S/G2-, G2- або S-Фаза клітинного циклу. Термін "зупинка або накопичення клітин в одній або більше фазах клітинного циклу" означає, що відсоток клітин, які перебувають у зазначеної одній або більш фазах клітинного циклу, збільшується. Для самовідтворення кожна клітина проходить цикл, який включає чотири фази. Перша фаза називається G1-фаза, у цій фазі клітина готується до подвоєння своїх хромосом. Друга фаза називається S-фаза, у цій фазі відбувається синтез і подвоєння ДНК. Наступна фаза – це G2-фаза, у ній відбувається подвоєння РНК і білка. Заключна фаза – це M-фаза, яка є фазою фактичного поділу клітини. У цій кінцевій стадії подвоєні ДНК і РНК розходяться й переміщаються до різних кінців клітини, і клітина дійсно ділиться на дві ідентичні, функціональні клітини. Хіміотерапевтичні засоби, які пошкоджують ДНК, як правило, призводять до накопичення клітин у фазі G1 і/або G2. Хіміотерапевтичні засоби, що перешкоджають клітинному росту, втручаючись у синтез ДНК, наприклад, антиметаболіти, як правило, призводять до накопичення клітин в S-Фазі. Прикладами цих лікарських засобів є 6-меркаптопурин і 5-фторурацил. Згідно з винаходом термін "засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2," включає антрацикліни, такі як епірубіцин, сполуки платини, такі як оксаліплатин і цисплатин, аналоги нуклеозидів, такі як 5-фторурацил або його проліки, таксани, такі як доцетаксел, і аналоги камптотецину, такі як іринотекан і топотекан, і комбінації лікарських препаратів, такі як комбінації лікарських засобів, які містять один або більше антрациклінів, таких як епірубіцин, оксаліплатин і 5-фторурацил, такі як комбінація лікарських засобів, які містить оксаліплатин і 5фторурацил, або інші описані тут лікарські комбінації. В одному з кращих варіантів здійснення "засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2," є "засобом, який викликає імуногенну загибель клітин". За певних обставин ракові клітини можуть вступати на шлях летального стресу, пов'язаного з виділенням визначеної із просторово-часової точки зору комбінації сигналів, яка перетворюється імунною системою на активацію пухлино-специфічних імунних відповідей (Zitvogel L. et al. (2010) Cell 140: 798-804). За такого розвитку подій ракові клітини починають виділяти сигнали, які сприймаються вродженими імунними ефекторами, такими як дендритні клітини, щоб ініціювати когнатну (cognate) імунну відповідь, яка зачіпає CD8+ Т-клітини й IFN-γ сигнальний шлях, так що загибель пухлинної клітини може викликати ефективну протипухлинну імунну відповідь. Ці сигнали включають предапоптотичну експозицію білка-шаперона ендоплазматичного ретикулума (ER) калретикуліну (CRT) на клітинній поверхні, 10 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 предапоптотичну секрецію АТФ і постапоптотичне вивільнення ядерного білка HMGB1. У сукупності ці процеси становлять молекулярні детермінанти імуногенної загибелі клітин (ICD). Антрацикліни, оксаліплатин і γ-опромінення здатні індукуватиусі сигнали, які визначають ICD, у той час як одного цисплатину, наприклад, недостатньо для індукції переміщення CRT від ER до поверхні клітин, що гинуть – процесу, який передбачає стрес ER - і потрібне додавання тапсигаргину, індуктора ER-стресу. Згідно з винаходом термін "засіб, який викликає імуногенну загибель клітин, " відноситься до засобу або комбінації засобів, наявність яких у клітинах, зокрема ракових клітинах, дозволяє стимулювати вступ клітини на шлях летального стресу, який в остаточному підсумку спричиняє пухлино-специфічні імунні відповіді. Зокрема, "засіб, який викликає імуногенну загибель клітин, " (при забезпеченні його наявності в клітинах) викликає виділення клітинами визначених із просторово-часової точки зору комбінації сигналів, включаючи, зокрема, предапоптотичну експозицію білка-шаперона ендоплазматичного ретикулума (ER) калретикуліну (CRT) на клітинній поверхні, предапоптотичну секрецію АТФ і постапоптотичне вивільнення ядерного білка HMGB1. Згідно з винаходом термін "засіб, який викликає імуногенну загибель клітин", включає антрацикліни й оксаліплатин. Антрацикліни – це клас лікарських засобів, які звичайно використовуються у хіміотерапії пухлин, також відомий за назвою антрациклінових антибіотиків. У структурному відношенні всі антрацикліни мають загальну структуру 7,8,9,10-тетрагідротетрацен-5,12-хінону, який має чотири кільця й звичайно потребують глікозилювання в специфічних сайтах. Антрацикліни переважно здійснюють один або більше із наступних механізмів дії: 1. Інгібування синтезу ДНК і РНК шляхом інтеркаляції між парами основ ДНК/РНК ланцюжка, що запобігає реплікації швидкозростаючих ракових клітин. 2. Інгібування ферменту топоізомерази II, що перешкоджає релаксації суперспіральної ДНК і в такий спосіб блокує транскрипцію й реплікацію ДНК. 3. Утворення залізо-опосередкованих вільних кисневих радикалів, що пошкоджують ДНК і мембрани клітин. Згідно з винаходом термін "антрациклін" переважно має відношення до препарату, бажано протипухлинного препарату, призначеного для індукції апоптозу, бажано шляхом інгібування повторного зв'язування (rebinding) ДНК із топоізомеразою. Бажано, згідно з винаходом термін "антрациклін" в основному відноситься до класу сполук, які мають наступну кільцеву структуру O O 35 40 OH OH включаючи аналоги й похідні, фармацевтичні солі, гідрати, складні ефіри, кон'югати та їх проліки. Приклади антрациклінів і аналогів антрациклінів включають, але не обмежуються цим, даунорубіцин (дауноміцин), доксорубіцин (адриаміцин), епірубіцин, ідарубіцин, родоміцин, пірарубіцин, валрубіцин, N-трифтор-ацетил доксорубіцин-14-валерат, аклациноміцин, морфолінодоксорубіцин (морфоліно-DOX), ціаноморфоліно-доксорубіцин (ціаноморфоліноDOX), 2-піроліно-доксорубіцин (2-PDOX), 5-імінодауноміцин, мітоксантрон і аклациноміцин A (акларубіцин). Мітоксантрон є членом класу антрацендіонів, аналогів антрациклінів, які втратили цукровий компонент антрациклінів, але, які зберегли плоску поліциклічну структуру ароматичних кілець, яка забезпечує можливість інтеркаляції в ДНК. Найкращим антрацикліном згідно з винаходом є сполуки наступної формули: 11 UA 115985 C2 O O OH R1 OH R2 O OH O NH2 O R3 R4 CH3 5 10 у якій R1 вибирають із групи, яка складається з H і OH, R 2 вибирають із групи, яка складається з H і ОМе, R3 вибирають із групи, яка складається з H і OH, і R4 вибирають із групи, яка складається з H і OH. В одному варіанті здійснення R1 є H, R2 є ОМе, R3 є H, і R4 є OH. В іншому варіанті здійснення R1 є OH, R2 є ОМе, R3 є H, і R4 є OH. В іншому варіанті здійснення R1 є OH, R2 є ОМе, R3 є OH, і R4 є H. В іншому варіанті здійснення R1 є H, R2 є H, R3 є H, і R4 є OH. Зокрема, передбачено, що антрацикліном в контексті даного винаходу є епірубіцин. Епірубіцин є антрацикліновим препаратом, який мають наступну формулу: O HO OH OH O H3C 15 20 25 O O OH O O CH3 OH NH2 і продається під торговою маркою еленс у США й під торговою маркою фарморубіцин або епірубіцин (Ebewe) в інших країнах. Зокрема, термін "епірубіцин" відноситься до сполуки (8R, 10S)-10-[(2S, 4S, 5R, 6S)-4-аміно-5-гідрокси-6-метил-оксан-2-іл]окси-6,11-дигідрокси-8-(2гідроксиацетил)-1-метокси-8-метил-9,10-дигідро-7H-тетрацен-5,12-діону. Епірубіцин є кращим у порівнянні з доксорубіцином, найбільш популярним антрацикліном, у деяких хіміотерапевтичних режимах, тому що, очевидно, він викликає менше побічних ефектів. Згідно з винаходом термін "сполука платини" має відношення до сполук, які містять платину у своїх структурах, таких як платинові комплекси, і включає такі сполуки, як цисплатин, карбоплатин і оксаліплатин. Термін "цисплатин" відноситься до сполуки цис-диамінодихлороплатини (II) (CDDP), яка має наступну формулу: Термін "карбоплатин" відноситься до сполуки циклобутандикарбоксилато)платини(II), яка має наступну формулу: цис-диаміно(1,1 Термін "оксаліплатин" відноситься до сполуки платини, яка утворює комплекс із диаміноциклогексаном, і яка має наступну формулу: 12 UA 115985 C2 10 Зокрема, термін "оксаліплатин" відноситься до сполуки [(1R, 2R)-циклогексан-1,2діамін](етандіоато-O, O')платина(II). Оксаліплатин для ін'єкцій також продається під торговою маркою елоксатин. Термін "нуклеозидний аналог" відноситься до структурного аналога нуклеозида, включаючи й аналоги пурину й аналоги піримідину. Зокрема, термін "нуклеозидний аналог" відноситься до похідних фторпіримідину, які включають фторурацил і його проліки. Термін "фторурацил" або "5-фторурацил" (5-FU або f5U) (продається під торговими марками Адруцил, Carac, Ефудикс, Ефудекс і Флюороплекс) відноситься до сполуки, яка є аналогом піримідину, і яка має наступну формулу: 15 Зокрема, термін відноситься до сполуки 5-фтор-1H-піримідин-2,4-діон. Термін "капецитабін" (Xeloda, Roche) відноситься до хіміотерапевтичного засобу, який є проліками, які перетворюється на 5-FU у тканинах. Капецитабін може вводитися перорально й має наступну формулу: 5 20 Зокрема, термін відноситься до сполуки пентил [1-(3,4-дигідрокси-5-метилтетрагідрофуран2-іл)-5-фтор-2-оксо-1Н-піримідин-4-іл]карбамат. Таксани представляють клас дитерпенових сполук, які спочатку були отримані із природних джерел, таких як рослини роду Taxus, а деякі були синтезовані штучно. Основним механізмом дії лікарських препаратів класу таксанів є порушення функції мікротрубочок, і в такий спосіб інгібування процесу клітинного поділу. Таксани включають доцетаксел (таксотер) і паклітаксел (таксол). Згідно з винаходом термін "доцетаксел" відноситься до сполуки, яка має наступну формулу: H3C CH3 H3C O HO O CH3 H3C O NH O CH3 O OH OH H3C O H HO O O O CH3 O 25 Згідно з винаходом термін "паклітаксел" відноситься до сполуки, яка має наступну формулу: 13 UA 115985 C2 O CH3 O O NH O H3C O OH 5 O OH CH3 CH3 CH3 O H O CH OH 3 O O O Згідно з винаходом термін "аналог камптотецину" відноситься до похідних сполуки камптотецину (CPT; (S)-4-етил-4-гідрокси-1H-пірано[3',4':6,7]індолізино [1,2-b] хінолін-3,14-(4H, 12H)-діон). Бажано, термін "аналог камптотецину" відноситься до сполук, які містять наступну структуру: O N O N O OH Згідно з винаходом кращими аналогами камптотецину є інгібітори ферменту ДНКтопоізомерази I (topo I). Кращими аналогами камптотецину згідно з винаходом є іринотекан і топотекан. Іринотекан є лікарським засобом, який запобігає розкручуванню ДНК шляхом інгібування топоізомерази I. З погляду хімії, він є напівсинтетичним аналогом природного алкалоїду камптотецину, який має наступну формулу: O H C H3C 10 3 N N N O O N O HO H3C Зокрема, термін "іринотекан" відноситься до сполуки (S)-4,11-диетил-3,4,12,14-тетрагідро-4гідрокси-3,14-діоксо1H-пірано[3",4":6,7]-індолізино[1,2-b]хінолін-9-іл-[1,4’біпиперидин]-1’карбоксилат. Топотекан є інгібітором топоізомерази, який має формулу: O H3C N O N H3C O N HO HO H3C Зокрема, термін "топотекан" відноситься до сполуки (S)-10-[(диметиламіно)метил]-4-етил4,9-дигідрокси-1H-пірано[3',4':6,7]індолізино[1,2-b]хінолін-3,14(4H, 12H)-діон моногідрохлорид. Згідно з винаходом засіб, який стабілізує або збільшує експресію CLDN18.2, може бути хіміотерапевтичним засобом, зокрема, хіміотерапевтичним засобом, визнаним у протипухлинній терапії, може бути частиною комбінації лікарських засобів, такої як комбінація лікарських засобів, загальноприйнята для застосування при лікуванні раку. Такою комбінацією лікарських засобів може бути комбінація лікарських засобів, які використовуються у хіміотерапії, і може бути комбінація лікарських засобів, які використовуються у хіміотерапевтичному режимі, обраному із групи, яка складається з EOX хіміотерапії, ECF хіміотерапії, ECX хіміотерапії, EOF хіміотерапії, FLO хіміотерапії, FOLFOX хіміотерапії, FOLFIRI хіміотерапії, DCF хіміотерапії й FLOT хіміотерапії. Комбінація лікарських засобів, які використовуються у режимі EOX хіміотерапії, включає епірубіцин, оксаліплатин і капецитабін. Комбінація лікарських засобів, які використовуються у режимі ECF хіміотерапії, включає епірубіцин, цисплатин і 5-фторурацил. Комбінація лікарських засобів, які використовуються у режимі ECX хіміотерапії, включає епірубіцин, цисплатин і O 15 20 25 30 14 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 капецитабін. Комбінація лікарських засобів, які використовуються у режимі EOF хіміотерапії, включає епірубіцин, оксаліплатин і 5-фторурацил. 2 2 Епірубіцин звичайно призначають у дозі 50 мг/м , цисплатин у дозі 60 мг/м , оксаліплатин у 2 2 дозі 130 мг/м , тривала венозна інфузія 5-фторурацилу в дозі 200 мг/м /день і перорально 2 капецитабін 625 мг/м два рази на день, усього вісім 3-тижневих циклів. Комбінація ліків, які використовуються у режимі хіміотерапії FLO, включає 5-фторурацил, 2 фолінову кислоту й оксаліплатин (зазвичай 5-фторурацил 2,600 мг/м 24-годинна інфузія, 2 2 фолінова кислота 200 мг/м і оксаліплатин 85 мг/м , кожні 2 тижні). FOLFOX – це режим хіміотерапії, який включає фолінову кислоту (лейковорин), 5фторурацил й оксаліплатину. Рекомендований режим дозування кожні два тижні виглядає наступним чином: День 1: Оксаліплатин 85 мг/м², внутрішньовенна (IV) інфузія й лейковорин 200 мг/м² IV інфузія, потім 5-FU 400 мг/м² IV уведення, потім 5-FU 600 мг/м² IV уведення у вигляді 22-годинного безперервного уливання; День 2: Лейковорин 200 мг/м² IV уливання протягом 120 хвилин, потім 5-FU 400 мг/м² IV уведення в протягом 2-4 хвилин, потім 5-FU 600 мг/м² IV уливання у вигляді 22-годинного безперервного уливання. Комбінація ліків, які використовуються у режимі хіміотерапії FOLFIRI, включає 5фторурацил, лейковорин і іринотекан. Комбінація ліків, які використовуються у режимі хіміотерапії DCF, включає доцетаксел, цисплатин і 5-фторурацил. Комбінація ліків, які використовуються у режимі хіміотерапії FLOT, включає доцетаксел, оксаліплатин, 5-фторурацил і фолінову кислоту. Термін "фолінова кислота" або "лейковорин" відноситься до сполуки, яка використовується в синергійній комбінації з хіміотерапевтичним препаратом 5-фторурацилом. Фолінова кислота має наступну формулу: Зокрема, термін відноситься до сполуки (2S)-2-{[4-[(2-аміно-5-форміл-4-оксо-5,6,7,8тетрагідро-1Н-птеридин-6-іл)метиламіно]бензоїл]аміно}пентандіова кислота. В одному варіанті здійснення даного винаходу стандартна хіміотерапія відповідно до EOX режиму у комбінації з антитілом, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, зокрема IMAB362, проводиться максимум протягом 8 циклів. Дози й режими можуть бути такими, як зазначено далі: 2 • 50 мг/м епірубіцину вводиться внутрішньовенно (i.v.) у вигляді 15 хвилинного уливання в 1 день кожного циклу протягом EOX фази. 2 • 130 мг/м оксаліплатину вводиться i.v. у вигляді 2-годинного уливання в 1 день кожного циклу протягом EOX фази. 2 • 625 мг/м капецитабіну призначається для перорального приймання (p.o.) два рази на день протягом 21 дня ранком і ввечері, починаючи з вечора першого дня кожного циклу протягом EOX фази. 2 • 1000 мг/м антитіл уводиться i.v. у вигляді 2-годинного уливання в 1 день циклу 1. Після 2 цього 600 мг/м антитіло вводиться i.v. у вигляді 2-годинного уливання в 1 день кожного наступного циклу після завершення уливання оксаліплатину. 2 • Після завершення хіміотерапії пацієнт продовжує приймання 600 мг/м антитіл у вигляді 2годинного уливання кожні 3 або 4 тижня. В одному варіанті здійснення даного винаходу стандартна хіміотерапія відповідно до EOXрежиму у комбінації з ZA/IL-2 і антитілом, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, зокрема IMAB362, проводиться аж до 8 циклів (24 тижня). Термін "антиген" має відношення до агента, такого як білок або пептид, який містить епітоп, на який спрямована або повинна бути спрямована імунна відповідь. У кращому варіанті здійснення антиген є асоційованим з пухлиною антигеном, таким як CLDN18.2, тобто, компонентом ракових клітин, які походять з цитоплазми, клітинної поверхні й клітинного ядра, зокрема, тих антигенів, які виробляються, переважно у великій кількості, внутрішньоклітинно або як поверхневі антигени на ракових клітинах. 15 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У контексті даного винаходу термін "асоційований з пухлиною" передусім має відношення до білків, які за нормальних умов специфічно експресуються в обмеженому числі тканин і/або органів або під час конкретних стадій розвитку й експресуються або ненормально експресуються в одній або більше пухлинних або ракових тканинах. У контексті даного винаходу асоційований з пухлиною бажано пов'язаний із клітинною поверхнею ракової клітини й бажано не експресується або тільки вкрай рідко експресується в нормальних тканинах. Термін "епітоп" відноситься до антигенної детермінанти в молекулі, тобто частини в молекулі, яка розпізнається імунною системою, наприклад, яка розпізнається антитілом. Наприклад, епітопи є окремими, тривимірними ділянками на антигені, які розпізнаються імунною системою. Звичайно епітопи складаються з хімічно активних поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і звичайно мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні й неконформаційні епітопи відрізняться тим, що зв'язування з першими, але не із другими, втрачається в присутності денатуруючих розчинників. Епітоп білка, такого як CLDN18.2, бажано містить безперервну або переривчасту частину зазначеного білка й переважно становить від 5 до 100, бажано від 5 до 50, ще краще від 8 до 30, найкраще від 10 до 25 амінокислот у довжину, наприклад, бажано епітоп може мати 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 амінокислот у довжину. Термін "антитіло" відноситься до глікопротеїну, який містить, щонайменше, два важкі (H) ланцюги й два легкі (L) ланцюги, взаємо-з'єднані дисульфідними зв'язками, і включає будь-яку молекулу, яка містить антигензв'язуючу ділянку. Термін "антитіло" включає моноклональні антитіла й фрагменти або похідні антитіл, включаючи, без обмеження, людські антитіла, гуманізовані антитіла, химерні антитіла, одноланцюгові антитіла, наприклад, scFv's і 1 антигензв'язуючі фрагменти антитіл, такі як Fab і Fab фрагменти, а також включає всі рекомбінантні форми антитіл, наприклад, антитіла, експресовані в прокаріотах, неглікозильовані антитіла й будь-які антигензв'язуючі фрагменти антитіл і похідні, як описується тут. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (позначається в описі VH) і константної області важкого ланцюга. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (позначається в описі VL) і константної області легкого ланцюга. Області VH і VL можна додатково розділити на області гіперваріабельності (гіпермінливі), які називаються гіперваріабельними ділянками (CDR), і які чергуються з ділянками, які є більш консервативними, які називаються каркасними ділянками (FR). Кожна VH і VL складається із трьох CDR і чотирьох FR, що розташовуються від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важкого й легкого ланцюга містять домен зв'язування, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканиною або факторами "хазяїна", включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Clq) класичної системи комплементу. Антитіла, описані в даному документі, можуть бути людськими антитілами. Використаний в описі термін "людське антитіло" включає антитіла, які мають варіабельну й константну області, джерелом походження яких є людські зародкові послідовності імуноглобуліну. Людські антитіла, описані в даному документі, можуть містити залишки амінокислот, не кодовані людськими зародковими послідовностями імуноглобуліну (наприклад, мутації, уведені шляхом випадкового або сайт-специфічного мутагенезу in vitro або шляхом соматичних мутацій in vivo). Термін "гуманізоване антитіло" відноситься до молекули, яка має ділянку зв'язування антигену, отриману в основному від імуноглобуліну такого виду тварин, який не є людиною, при цьому інша частина молекули імуноглобуліну ґрунтується на структурі й/або послідовності імуноглобуліну людини. Ділянка зв'язування антигену може містити або повні варіабельні домени, приєднані до константних доменів, або тільки гіперваріабельні ділянки (CDR), приєднані до придатних каркасних ділянок у варіабельних доменах. Ділянки зв'язування антигену можуть бути дикого типу або модифікованими за допомогою однієї або більше амінокислотних замін, наприклад, модифікованими для того, щоб бути більш подібними на людський імуноглобулін. Деякі форми гуманізованих антитіл зберігають усі CDR-послідовності (наприклад, гуманізоване мишаче антитіло, яке містить усі шість CDR від мишачого антитіла). Інші форми мають один або більше CDR, змінених у порівнянні з первинним антитілом. Термін "химерне антитіло" відноситься до антитіл, у яких одна частина кожної з амінокислотних послідовностей важкого й легкого ланцюгів є гомологічною до відповідних послідовностей в антитілі, отриманому від конкретного виду або яке належить до певного класу, тоді як інший сегмент ланцюга є гомологічним до відповідної послідовності іншого виду. Звичайно варіабельна ділянка й легкого й важкого ланцюгів копіює варіабельні ділянки антитіл, 16 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отримані від одного виду ссавців, тоді як константні частини є гомологічними до послідовностей антитіл, отриманих від іншого виду. Однією очевидною перевагою таких химерних форм є те, що варіабельну ділянку можна легко одержати з відомих на цей час джерел, використовуючи легкодоступні B-клітини або гібридоми від організмів-хазяїв, які не є людиною, у комбінації з константними областями, отриманими, наприклад, із препаратів клітин людини. При цьому, варіабельна область має перевагу, яка полягає в легкості одержання, а специфічність не підпадає під вплив джерела, константна область, будучи людською, менш імовірно викличе імунну відповідь у людини при введенні антитіл, ніж викликала б константна область із джерела, яке не є людиною. Однак дане визначення не обмежується цим окремим прикладом. Терміни "антигензв'язуюча ділянка" антитіла (або просто "ділянка зв'язування") або "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла (або просто "зв'язувальний фрагмент") або подібні терміни відносяться до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном. Показано, що антигензв'язуюча функція антитіла може здійснюватися фрагментами повнорозмірного антитіла. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплені терміном "антигензв'язуюча ділянка" антитіла, включають (i) Fab фрагменти, одновалентні фрагменти, які складаються із VL, VH, CL і CH доменів; (ii) F(ab')2 фрагменти, двовалентні фрагменти, що містять два Fab-фрагменти, з'єднані дисульфідним містком у шарнірній області; (iii) Fd фрагменти, які складаються із VH і CH доменів; (iv) Fv фрагменти, які складаються із VL і VH доменів одноланцюгових антитіл, (v) dAb фрагменти (Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546), які складаються із VH домена; (vi) ізольовані гіперваріабельні ділянки (CDR) і (vii) комбінації двох або більше ізольованих CDR, які необов'язково можуть з'єднуватися синтетичним лінкером. Крім того, хоча два домена Fv фрагмента, VL і VH, кодуються окремими генами, їх можна з'єднати, використовуючи рекомбінантні методи, за допомогою синтетичних лінкерів, що дає їм можливість формувати єдиний білковий ланцюг, у якому VL і VH області розташовуються парами, щоб утворювати одновалентні молекули (відомі як одноланцюговий Fv (scFv); дивися, наприклад, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; і Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також охоплюються терміном "антигензв'язуюча ділянка" антитіла. Додатковим прикладом є домен-зв'язувальні гібридні імуноглобуліни, які містять (i) поліпептидний домен зв'язування, який приєднується до шарнірної області імуноглобуліну, (ii) константну область CH2 важкого ланцюга імуноглобуліну, приєднану до шарнірної області, і (iii) константну область CH3 важкого ланцюга імуноглобуліну, приєднану до константної області CH2. Зв'язувальний домен поліпептиду може бути варіабельною областю важкого ланцюга або варіабельною областю легкого ланцюга. Домен-зв'язувальні імуноглобулінові гібридні білки додатково розкриваються в США 2003/0118592 і США 2003/0133939. Ці фрагменти антитіл одержують за допомогою звичайних методів, відомих фахівцям у даній галузі техніки, при цьому фрагменти зазнають скринінгу щодо їх придатності, так само, як і інтактні антитіла. Термін "біспецифічна молекула" включає будь-який агент, наприклад, білок, пептид або білковий або пептидний комплекс, який має дві різні специфічності зв'язування. Наприклад, молекула може зв'язуватися з або взаємодіяти з (a) антигеном клітинної поверхні, і (b) Fcрецептором на поверхні ефекторної клітини. Термін "мультиспецифічна молекула" або "гетероспецифічна молекула" включає будь-який агент, наприклад, білок, пептид або білковий або пептидний комплекс, який має більш ніж дві різні специфічності зв'язування. Наприклад, молекула може зв'язуватися з або взаємодіяти з (a) антигеном клітинної поверхні й (b) Fcрецептором на поверхні ефекторної клітини й (c), щонайменше, з одним іншим компонентом. Відповідно, винахід включає, але не обмежується цим, біспецифічні, триспецифічні, тетраспецифічні та інші мультиспецифічні молекули, спрямовані на CLDN18.2 і на інші мішені, такі як Fc-рецептори на ефекторних клітинах. Термін "біспецифічні антитіла" також включає діабоди (diabodies). Діабоди є двовалентними біспецифічними антитілами, у яких VH і VL домени експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, який є занадто коротким, щоб дати можливість розташовуватися парами між двома доменами на одному й тому ж ланцюзі, таким чином, змушуючи домени утворювати пари з комплементарними доменами іншого ланцюга й породжуючи дві антигензв'язуючі ділянки (дивися, наприклад, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Антитіло може бути кон'югованим з терапевтичною молекулою або агентом, таким як цитотоксин, лікарським засобом (наприклад, імуносупресорним засобом) або радіоізотопом. Цитотоксин або цитотоксичний засіб включає будь-який засіб, який завдає шкоди й, зокрема, знищує клітини. Приклади включають таксол, цитохалазин B, граміцидин D, етидіум бромід, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, 17 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даунорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин та їх аналоги або гомологи. Придатні для утворення кон'югатів з антитілами терапевтичні засоби включають, але не обмежуються цим, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, 6меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, флударабін, 5-фторурацил декарбазин), алкілюючі засоби (наприклад, мехлоретамін, тіотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) і ломустин (CCNU), циклофосфамід, бусулфан, дибромманітол, стрептозотоцин, мітоміцин C, і цис-дихлородиамін платини (II) (DDP) цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (раніше даунорубіцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (раніше актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (AMC), і антимітотичні засоби (наприклад, вінкристин і вінбластин). У кращому варіанті здійснення терапевтичний засіб є цитотоксичним засобом або радіотоксичним засобом. В іншому варіанті здійснення терапевтичний засіб є імуносупресорним засобом. В іншому варіанті здійснення терапевтичний засіб є GM-CSF. У кращому варіанті здійснення терапевтичний засіб є доксорубіцином, цисплатином, блеоміцином, сульфатом, кармустином, хлорамбуцилом, циклофосфамідом або рицином A. Антитіла також можуть бути кон'юговані з радіоізотопом, наприклад, йодом-131, ітрієм-90 або індієм-111, для одержання цитотоксичних радіофармацевтичних засобів. Кон'югати антитіл запропоновані винаходом можна використовувати для того, щоб модифікувати дану біологічну відповідь, при цьому лікарська частка (drug moiety) не повинна розглядатися як така, що обмежує застосування класичних хімічних терапевтичних лікарських засобів. Наприклад, лікарська частка може бути білком або поліпептидом, які проявляють бажану біологічну активність. Такий білок може включати, наприклад, ферментативно активний токсин, або його активний фрагмент, такий як абрин, рицин A, екзотоксин синьогнійної палички або дифтерійний токсин; білок, такий як фактор некрозу пухлини або інтерферон-γ; або модифікатори біологічної відповіді такі як, наприклад, лімфокіни, інтерлейкін-1 ("IL-1"), інтерлейкін-2 ("IL-2"), інтерлейкін-6 ("IL-6"), гранулоцитарно-моноцитарний колонієстимулюючий фактор ("GM-CSF"), гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор ("G-CSF") або інші фактори росту. Методи кон'югування такої терапевтичної частки з антитілом добре відомі, дивися, наприклад, Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pincheraet al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) і Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). При використанні в описі виразу антитіло "походить від" окремої зародкової послідовності, якщо антитіло отримане із системи шляхом імунізації тварини або шляхом скринінга бібліотеки генів імуноглобулінів, і при цьому обране антитіло є, щонайменше, на 90 %, більш бажано, щонайменше, на 95 %, навіть ще краще, щонайменше, на 96 %, 97 %, 98 %, або 99 % аналогічним до послідовності амінокислот у порівнянні з послідовністю амінокислот, яка кодується зародковим геном імуноглобуліну. Як правило, антитіло, джерелом походження якого є окрема зародкова послідовність, буде демонструвати не більше ніж 10 амінокислотних відмінностей, більш бажано, не більше ніж 5, або навіть ще краще, не більше, ніж 4, 3, 2 або 1 амінокислотну відмінність від амінокислотної послідовності, яка кодується зародковим геном імуноглобуліну. Термін "гетероантитіла", як він використовується в описі відноситься до двох або більше антитіл, їх похідних або антигензв'язуючих ділянок, з'єднаним разом, щонайменше, дві з яких мають різні специфічності. Ці різні специфічності включають специфічність зв'язування для Fcрецептора на ефекторній клітині й специфічність зв'язування для антигену або епітопа на клітині-мішені, наприклад, пухлинній клітині. Описані в даному документі антитіла можуть бути моноклональними антитілами. Термін "моноклональне антитіло", як він використовується в описі відноситься до препарату молекул антитіл з однаковим молекулярним складом. Моноклональне антитіло має одну специфічність зв'язування й спорідненість до окремого епітопу. В одному варіанті здійснення моноклональні антитіла виробляються за допомогою гібридоми, яка включає В-клітину, отриману від тварини, яка не є людиною, наприклад, миші, з'єднану з іморталізованою клітиною. 18 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Описані в даному документі антитіла можуть бути рекомбінантними антитілами. Термін "рекомбінантне антитіло", як він використовується в описі включає всі антитіла, які виходять, експресуються, створюються або виділяються за допомогою рекомбінантних способів, наприклад, (a) антитіла, виділені із тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною або трансхромосомною відносно генів імуноглобулінів або гібридоми, отриманої з них, (b) антитіла, виділені із клітини-хазяїна, трансформованої для того, щоб вона експресувала антитіла, наприклад, із трансфектоми, (c) антитіла, виділені з комбінаторної бібліотеки рекомбінантних антитіл, і (d) антитіла отримані, експресовані, створені або виділені будь-якими іншими способами, які стосуються сплайсинг послідовностей генів імуноглобулінів з іншими ДНКпослідовностями. Джерелом походження описаних в даному документі антитіл можуть бути різні види, включаючи, але не обмежуючись цим, мишу, пацюка, кролика, морську свинку й людину. Описані в даному документі антитіла включають поліклональні й моноклональні антитіла й включають IgA, такі як IgA1 або IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, і IgD антитіла. У різних варіантах здійснення антитіло є IgG1 антитілом, конкретніше IgG1, каппа або IgG1, лямбда ізотипом (тобто IgG1, κ, λ), IgG2a антитілом (наприклад, IgG2a, κ, λ), IgG2b антитілом (наприклад, IgG2b, κ, λ), IgG3 антитілом (наприклад, IgG3, κ, λ) або IgG4 антитілом (наприклад, IgG4, κ, λ). Термін "трансфектома", як він використовується в описі включає рекомбінантні еукаріотичні клітини-хазяї, які експресують антитіло, такі як клітини CHO, клітини NS/0, клітини НЕК293, клітини HEK293T, рослинні клітини або клітини грибів, включаючи клітини дріжджів. Термін "гетерологічне антитіло", як він використовується в описі, визначається з погляду трансгенного організму, який продукує таке антитіло. Цей термін відноситься до антитіла, яке має амінокислотну послідовність або яке кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка відповідає послідовності, виявленій в організмі, який не містить трансгенний організм, і як правило, отриманому від іншого виду, ніж трансгенний організм. Термін "гетерогібридне антитіло", як він використовується в описі, відноситься до антитіла, яке має легкий і важкий ланцюги від різних організмів. Наприклад, антитіло, яке має людський важкий ланцюг, з'єднаний з мишачим легким ланцюгом, є гетерогібридним антитілом. Винахід включає всі антитіла й похідні антитіл, описані тут, які для цілей винаходу охоплюються терміном "антитіло". Термін "похідні антитіл" відноситься до будь-якої модифікованої форми антитіла, наприклад, кон'югату антитіла й іншого агента або антитіла або фрагмента антитіла. Описані тут антитіла бажано є ізольованими. Термін "ізольоване антитіло", як він використовується в описі, відноситься до антитіла, яке в основному є вільним від інших антитіл, які мають інші антигенні специфічності (наприклад, ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язується з CLDN18.2, є в основному вільним від антитіл, які специфічно зв'язують антигени, відмінні від CLDN18.2). Однак, ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом, ізоформою або варіантом людського CLDN18.2, може мати перехресну реактивність до інших споріднених антигенів, наприклад, від інших видів (наприклад, видових гомологів CLDN18.2). Більше того, ізольоване антитіло може бути в основному вільним від іншого клітинного матеріалу й/або хімічних речовин. В одному варіанті здійснення винаходу комбінація "ізольованих" моноклональних антитіл має відношення до антитіл, які мають різні специфічності й об'єднані у чітко визначену композицію або суміш. Термін "зв'язування" згідно з винаходом, переважно має відношення до специфічного зв'язування. Згідно із даним винаходом антитіло є здатним зв'язуватися з певною мішенню, якщо воно має значну спорідненість до зазначеної певної мішені й зв'язується із зазначеною певною мішенню в стандартних методах дослідження. "Спорідненість" або "спорідненість зв'язування" часто оцінюється рівноважною константою дисоціації (KD). Бажано термін "значна спорідненість" -5 відноситься до зв'язування з певною мішенню з константою дисоціації (KD) 10 M або нижче, 10 6 -7 -8 -9 -10 -11 M або нижче, 10 M або нижче, 10 M або нижче, 10 M або нижче, 10 M або нижче, 10 M -12 або нижче або 10 M або нижче. Антитіло не є здатним (значно) зв'язуватися з мішенню, якщо воно не має значної спорідненості із зазначеною мішенню й не зв'язується значною мірою, зокрема, не зв'язується, в тій мірі, яка піддається виявленню, із зазначеною мішенню за стандартних методів аналізу. Бажано антитіло не зв'язується, в тій мірі, яка піддається виявленню із зазначеною мішенню, якщо воно присутнє у концентрації до 2, бажано до 10, ще краще, до 20, зокрема 50 або 100 мкг/мл або вище. Бажано антитіло не має значної спорідненості до мішені, якщо воно 3 зв'язується із зазначеною мішенню з KD, який є, щонайменше, в 10 разів, 100 разів, 10 разів, 19 UA 115985 C2 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5 6 10 разів, 10 разів або 10 разів вищим, ніж KD зв'язування з певною мішенню, з якою здатне зв'язуватися антитіло. Наприклад, якщо KD зв'язування антитіла з мішенню, з якою здатне -7 зв'язуватися антитіло, становив 10 M, то тоді KD зв'язування з мішенню, до якої антитіло не має -6 -5 -4 -3 -2 -1 значної спорідненості, становив би, щонайменше, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M або 10 M. Антитіло є специфічним для зазначеної мішені, якщо воно здатне зв'язуватися із зазначеною певною мішенню, тоді як воно не здатне зв'язуватися з іншими мішенями, тобто має незначну спорідненість до інших мішеней і незначно зв'язується з іншими мішенями за стандартних методів аналізу. Згідно з винаходом антитіло є специфічним до CLDN18.2, якщо воно здатне зв'язуватися з CLDN18.2, але (практично) не здатне зв'язуватися з іншими мішенями. Бажано, антитіло є специфічним до CLDN18.2, якщо спорідненість і зв'язування з іншими мішенями не перевищує значної спорідненості до або зв'язування з білками, неспорідненими з CLDN18.2, такими як бичачий сироватковий альбумін (BSA), казеїн, людський сироватковий альбумін (HSA) або трансмембранні білки, які не є клаудинами, такі як молекули MHC або рецептор трансферину або будь-який інший специфічний поліпептид. Бажано антитіло є специфічним для визначеної мішені, якщо воно зв'язується із зазначеною мішенню з KD, який 3 4 5 6 є, щонайменше, в 10 разів, 100 разів, 10 разів, 10 разів, 10 разів або 10 разів меншим, ніж KD зв'язування з мішенню, яка не є специфічною. Наприклад, якщо KD зв'язування антитіла з -7 мішенню, яка є специфічною становить 10 M, то тоді KD зв'язування з мішенню, яка не є -6 -5 -4 -3 -2 -1 специфічною, мабуть, щонайменше, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M або 10 M. Зв'язування антитіла з мішенню можна визначити експериментально, використовуючи будьякий придатний метод, дивися, наприклад, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Jam's Immunology, W. H. Freeman і Company New York, N Y (1992), і описані тут методи. Спорідненість можна легко визначити за допомогою звичайних методів, таких як рівноважний діаліз; за допомогою приладу Biacore 2000, використовуючи загальні методики, запропоновані виробником; за допомогою радіоімунологічного аналізу з використанням міченого радіоактивним ізотопом цільового антигену або іншими методами, відомими фахівцям. Дані щодо спорідненості можна проаналізувати, наприклад, за допомогою методу Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Scl, 51:660 (1949). Величина, яка характеризує спорідненість окремої взаємодії антитіло-антиген може варіювати, якщо вимірювання проводилося за різних умов, наприклад, концентрації солі, pН. Таким чином, вимірювання спорідненості й інших параметрів зв'язування антигену, наприклад, KD, IC50, бажано проводяться за допомогою стандартизованих розчинів антитіла й антигену й стандартизованого буфера. Термін "ізотип", як він використовується в описі, відноситься до класу антитіл (наприклад, IgM або IgG 1), які кодуються генами константної області важкого ланцюга. Термін "перемикання ізотипа", як він використовується в описі, відноситься до явища, за допомогою якого клас або ізотип антитіла змінюється від одного класу Ig до одного з інших класів Ig. Термін "природний", як він використовується в описі, стосовно об'єкта відноситься до тієї обставини, що об'єкт може бути знайдений у природі. Наприклад, послідовність поліпептиду або полінуклеотиду, яка є присутньою в організмі (включаючи віруси), і яка може бути виділеною із природного джерела, і яка не була навмисно модифікована людиною в лабораторії, є природною. Термін "перегрупована", як він використовується в описі, відноситься до конФігурації важкого ланцюга або легкого ланцюга імуноглобулінового локусу, у якому V сегмент розташовується безпосередньо поруч із D-J або J сегментом у конформації, що кодує фактично повний VH або VL домен, відповідно. Перегрупований генний локус імуноглобуліну (антитіла) може бути встановлений шляхом порівняння із зародковою ДНК; перегрупований локус буде мати, щонайменше, один рекомбінований семичленний/дев'ятичленний гомологічний елемент. Терміни "перегрупування" або "зародкова конфігурація", як вони використовуються в описі, стосовно V сегмента відноситься до конФігурації, у якій V сегмент є нерекомбінованим для того, щоб бути безпосередньо поруч із D або J сегментом. Згідно з винаходом антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, є антитілом, здатним зв'язуватися з епітопом, присутнім на CLDN18.2, переважно епітопом, розташованим у межах позаклітинних доменів CLDN18.2, зокрема першому позаклітинному домені, бажано о в положеннях амінокислот від 29 до 78 CLDN18.2. В окремих варіантах здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, є антитілом, здатним зв'язуватися з (i) епітопом на CLDN18.2, не присутнім на CLDN18.1, бажано SEQ ID NO: 3, 4 і 5, (ii) епітопом, розташованим на CLDN18.2 – петля1, бажано SEQ ID NO: 8, (iii) епітопом, розташованим на CLDN18.2-петля2, бажано SEQ ID NO: 10, (iv) епітопом, розташованим на CLDN18.2-петляD3, бажано SEQ ID NO: 20 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11, (v) епітопом, який містить CLDN18.2-петлю1 і CLDN18.2-петлюD3, або (vi) неглікозильованим епітопом, розташованим на CLDN18.2-петляD3, бажано SEQ ID NO: 9. Згідно з винаходом антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, бажано є антитілом, здатним зв'язуватися CLDN18.2, але не з CLDN18.1. Бажано, антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, є специфічним до CLDN18.2. Бажано, антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, бажано є антитілом, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, експресованим на клітинній поверхні. В окремих кращих варіантах здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, зв'язується з нативними епітопами CLDN18.2, присутніми на поверхні живих клітин. Бажано, антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, зв'язується з одним або більше пептидами, обраними із групи, яка складається з SEQ ID №: 1, 3-11, 44, 46, і 48-50. Бажано, антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, є специфічним для згаданих вище білків, пептидів або імуногенних фрагментів або їх похідних. Антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, може бути отримане способом, який включає стадію імунізації тварини білком або пептидом, який містять амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з SEQ ID №: 1, 3-11, 44, 46, і 48-50, або нуклеїнову кислоту або клітину-хазяїна, яка експресує зазначений білок або пептид. Бажано, антитіло зв'язується з раковими клітинами, зокрема клітинами згаданих вище типів раку й, бажано, практично не зв'язується з нераковими клітинами. Бажано, зв'язування антитіла, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, із клітинами, які експресують CLDN18.2, викликає або опосередковує знищення клітин, які експресують CLDN18.2. Клітини, які експресують CLDN18.2, бажано є раковими клітинами, і, зокрема, їх вибирають із групи, яка складається зі злоякісних клітин раку шлунка, стравоходу, підшлункової залози, легенів, яєчника, товстої кишки, печінки, голови і шиї й жовчного міхура. Бажано, антитіло викликає або опосередковує знищення клітин, індукуючи один або більше із поміж опосередкованого комплементзалежною цитотоксичністю (CDC) лізису, опосередкованого антитілозалежною клітинноопосредкованою цитотоксичністю (ADCC) лізису, апоптозу й інгібування проліферації клітин, які експресують CLDN18.2. Бажано, ADCC-опосередкований лізис відбувається в присутності ефекторних клітин, які в окремих варіантах здійснення вибирають із групи, яка складається з моноцитів, мононуклеарних клітин, NK-клітин і PMNs. Інгібування проліферації клітин можна вимірювати in vitro шляхом визначення проліферації клітин методом аналізу із застосуванням бромдезоксиуридіну (5-бром-2-дезоксиуридін, BrdU). BrdU є синтетичним нуклеозидом, аналогом тимідину, і може вбудовуватися в знову синтезовану ДНК клітин, які відтворюються шляхом клітинного поділу (у ході S фази клітинного циклу), заміняючи тимідин під час реплікації ДНК. Виявлення "включеної" хімічної речовини за допомогою, наприклад, антитіл, специфічних до BrdU, указує на клітини, які активно відтворювали свою ДНК. У кращих варіантах здійснення описані в даному документі антитіла можуть бути охарактеризовані за однією або більше із наступних властивостей: a) специфічність до CLDN18.2; b) афінність зв'язування з CLDN18.2 близько 100 нM або менше, бажано, близько 5-10 нM або менше і ще краще, близько 1-3 нM або менше, c) здатність викликати або опосередковувати CDC CLDN18.2-позитивних клітин; d) здатність викликати або опосередковувати ADCC CLDN18.2-позитивних клітин; e) здатність інгібувати ріст CLDN18.2-позитивних клітин; f) здатність викликати апоптоз CLDN18.2-позитивних клітин. В окремому кращому варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, виробляється гібридомою, депонованою в DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Germany; new address: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Germany), яка має наступне позначення й обліковий номер: a. 182-D1106-055, обліковий номер DSM ACC2737, депонована 19 жовтня 2005 b. 182-D1106-056, обліковий номер DSM ACC2738, депонована 19 жовтня 2005 c. 182-D1106-057, обліковий номер DSM ACC2739, депонована 19 жовтня 2005 d. 182-D1106-058, обліковий номер DSM ACC2740, депонована 19 жовтня 2005 e. 182-D1106-059, обліковий номер DSM ACC2741, депонована 19 жовтня 2005 f. 182-D1106-062, обліковий номер DSM ACC2742, депонована 19 жовтня 2005 g. 182-D1106-067, обліковий номер DSM ACC2743, депонована 19 жовтня 2005 h. 182-D758-035, обліковий номер DSM ACC2745, депонована 17 листопада 2005 i. 182-D758-036, обліковий номер DSM ACC2746, депонована 17 листопада 2005 j. 182-D758-040, обліковий номер DSM ACC2747, депонована 17 листопада 2005 k. 182-D1106-061, обліковий номер DSM ACC2748, депонована 17 листопада 2005 21 UA 115985 C2 5 10 l. 182-D1106-279, обліковий номер DSM ACC2808, депонована 26 жовтня 2006 m. 182-D1106-294, обліковий номер DSM ACC2809, депонована 26 жовтня 2006 n. 182-D1106-362, обліковий номер DSM ACC2810, депонована 26 жовтня 2006. Кращими антитілами згідно з винаходом є антитіла, які виробляються або одержані за допомогою вищезгаданих гібридом; тобто 37G11 у випадку 182-D1106-055, 37H8 у випадку 182D1106-056, 38G5 у випадку 182-D1106-057, 38H3 у випадку 182-D1106-058, 39F11 у випадку 182-D1106-059, 43A11 у випадку 182-D1106-062, 61C2 у випадку 182-D1106-067, 26B5 у випадку 182-D758-035, 26D12 у випадку 182-D758-036, 28D10 у випадку 182-D758-040, 42E12 у випадку 182-D1106-061, 125E1 у випадку 182-D1106-279, 163E12 у випадку 182-D1106-294, і 175D10 у випадку 182-D1106-362; та їх химерних й гуманізованих форм. Кращі химерні антитіла та їх послідовності показані в наступній таблиці. клон 15 20 25 30 35 40 варіабельна область химерне антитіло 43A11 182-D1106-062 IgG2a SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:14 182-D1106-294 182-D1106-279 182-D1106-308 182-D1106-362 182-D758-187 IgG3 IgG2a IgG3 IgG1 IgG2a SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:19 43A11 182-D1106-062 IgK SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:21 163E12 125E1 166E2 175D10 45C1 45C1 45C1 45C1 Легкий ланцюг ізотип 163E12 125E1 166E2 175D10 45C1 Важкий ланцюг mab 182-D1106-294 182-D1106-279 182-D1106-308 182-D1106-362 182-D758-187 182-D758-187 182-D758-187 182-D758-187 IgK IgK IgK IgK IgK IgK IgK IgK SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 У кращих варіантах здійснення антитіла, зокрема, химерні форми антитіл запропоновані винаходом, включають антитіла, які містять константну область важкого ланцюга (CH) яка включає, амінокислотну послідовність, яка походить з людської константної області важкого ланцюга, таку як амінокислотна послідовність, представлена SEQ ID NO: 13, або її фрагмент. У додаткових кращих варіантах здійснення, антитіла, зокрема, химерні форми антитіл запропоновані винаходом, включають антитіла, які містять константну область легкого ланцюга (CL) яка включає, амінокислотну послідовність, яка походить з людської константної області легкого ланцюга, таку як амінокислотна послідовність, представлена SEQ ID NO: 12, або її фрагмент. В окремому кращому варіанті здійснення антитіла, зокрема, химерні форми антитіл запропоновані винаходом, включають антитіла, які містять CH, яка включає амінокислотну послідовність, яка походить від людської CH, таку як амінокислотна послідовність, представлена SEQ ID NO: 13, або її фрагмент, і які містять CL, яка включає амінокислотну послідовність, яка походить від людської CL, таку як амінокислотна послідовність, представлена SEQ ID NO: 12, або її фрагмент. В одному варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, є химерним миша/людина IgG1 моноклональним антитілом, яке містить мишачу каппа варіабельну область легкого ланцюга, людську каппа константну область легкого ланцюга алотип Km(3), мишачу варіабельну область важкого ланцюга, константну область людського IgG1, алотип G1m(3). У деяких кращих варіантах здійснення химерні форми антитіл включають антитіла, які містять важкий ланцюг, який включає амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з SEQ ID Nos: 14, 15, 16, 17, 18, 19, і її фрагмента, і/або які містять легкий ланцюг, який включає амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з SEQ ID Nos: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, та її фрагмента. У деяких кращих варіантах здійснення химерні форми антитіл включають антитіла, які містять комбінацію важких ланцюгів і легких ланцюгів, обраних з наступних можливих варіантів (i) - (ix): (i) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 14, або її 22 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 21, або її фрагмент, (ii) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 15, або її фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 20, або її фрагмент, (iii) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 16, або її фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 22, або її фрагмент, (iv) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 18, або її фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 25 або її фрагмент, (v) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 17, або її фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 24, або її фрагмент, (vi) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 19, або її фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 23, або її фрагмент, (vii) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 19, або її фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 26, або її фрагмент, (viii) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 19, або її фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 27, або її фрагмент, і (ix) важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 19, або її фрагмент, і легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 28, або її фрагмент. Термін "фрагмент" або "фрагмент амінокислотної послідовності", як він використовується в описі, має відношення до частини послідовності антитіла, тобто послідовності, яка є послідовністю антитіла, укороченою на N- і/або C-кінцях, і яка, у тому випадку, коли вона заміняє зазначену послідовність антитіла в антитілі, зберігає здатність зв'язування зазначеного антитіла з CLDN18.2 і бажано функції зазначеного антитіла, описані тут, наприклад, CDCопосередкований лізис або ADCC-опосередкований лізис. Бажано, фрагмент амінокислотної послідовності містить, щонайменше, 80 %, бажано, щонайменше, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % амінокислотних залишків від зазначеної амінокислотної послідовності. Фрагмент амінокислотної послідовності, обраний із групи, яка складається з SEQ ID Nos: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 і 28, бажано має відношення до зазначеної послідовності, у якій 17, 18, 19, 20, 21, 22 або 23 амінокислоти вилучені на N-кінці. У кращому варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, містить важкий ланцюг варіабельної області (VH), який включає амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з SEQ ID Nos: 29, 30, 31, 32, 33, 34 та їх фрагмента. У кращому варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, містить легкий ланцюг варіабельної області (VH) який включає амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 та їх фрагмента. У деяких кращих варіантах здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, містить комбінацію важкого ланцюга варіабельної області (VH) і легкого ланцюга варіабельної області (VL), обрану з наступних можливих варіантів (i) - (ix): (i) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 29, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 36, або її фрагмент, (ii) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 30, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 35, або її фрагмент, (iii) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 31, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 37, або її фрагмент, (iv) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 33, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 40, або її фрагмент, (v) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 32, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 39, або її фрагмент, (vi) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 34, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 38, або її фрагмент, (vii) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 34, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 41, або її фрагмент, 23 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (viii) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 34, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 42, або її фрагмент, (ix) VH містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 34, або її фрагмент, і VL містить амінокислотну послідовність, представлену SEQ ID NO: 43, або її фрагмент. У кращому варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, містить VH, що включає набір гіперваріабельних ділянок CDR1, CDR2 і CDR3, обраних з поміж наступних варіантів здійснення (i) - (vi): (i) CDR1: положення 45-52 SEQ ID NO: 14, CDR2: положення 70-77 SEQ ID NO: 14, CDR3: положення 116-125 SEQ ID NO: 14, (ii) CDR1: положення 45-52 SEQ ID NO: 15, CDR2: положення 70-77 SEQ ID NO: 15, CDR3: положення 116-126 SEQ ID NO: 15, (iii) CDR1: положення 45-52 SEQ ID NO: 16, CDR2: положення 70-77 SEQ ID NO: 16, CDR3: положення 116-124 SEQ ID NO: 16, (iv) CDR1: положення 45-52 SEQ ID NO: 17, CDR2: положення 70-77 SEQ ID NO: 17, CDR3: положення 116-126 SEQ ID NO: 17, (v) CDR1: положення 44-51 SEQ ID NO: 18, CDR2: положення 69-76 SEQ ID NO: 18, CDR3: положення 115-125 SEQ ID NO: 18, і (vi) CDR1: положення 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положення 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положення 117-128 SEQ ID NO: 19. У кращому варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, містить VL, що включає набір гіперваріабельних ділянок CDR1, CDR2 і CDR3, обраних з поміж наступних варіантів здійснення (i) - (ix): (i) CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 20, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 20, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 20, (ii) CDR1: положення 49-53 SEQ ID NO: 21, CDR2: положення 71-73 SEQ ID NO: 21, CDR3: положення 110-118 SEQ ID NO: 21, (iii) CDR1: положення 47-52 SEQ ID NO: 22, CDR2: положення 70-72 SEQ ID NO: 22, CDR3: положення 109-117 SEQ ID NO: 22, (iv) CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 23, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 23, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 23, (v) CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 24, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 24, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 24, (vi) CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 25, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 25, CDR3: положення 115-122 SEQ ID NO: 25, (vii) CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 26, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 26, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 26, (viii) CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 27, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 27, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 27, і (ix) CDR1: положення 47-52 SEQ ID NO: 28, CDR2: положення 70-72 SEQ ID NO: 28, CDR3: положення 109-117 SEQ ID NO: 28. У кращому варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, містить комбінацію VH і VL, кожна з яких включає набір гіперваріабельних ділянок CDR1, CDR2 і CDR3, обраних з поміж наступних варіантів здійснення (i) - (ix): (i) VH: CDR1: положення 45-52 SEQ ID NO: 14, CDR2: положення 70-77 SEQ ID NO: 14, CDR3: положення 116-125 SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: положення 49-53 SEQ ID NO: 21, CDR2: положення 71-73 SEQ ID NO: 21, CDR3: положення 110-118 SEQ ID NO: 21, (ii) VH: CDR1: положення 45-52 SEQ ID NO: 15, CDR2: положення 70-77 SEQ ID NO: 15, CDR3: положення 116-126 SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 20, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 20, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 20, (iii) VH: CDR1: положення 45-52 SEQ ID NO: 16, CDR2: положення 70-77 SEQ ID NO: 16, CDR3: положення 116-124 SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: положення 47-52 SEQ ID NO: 22, CDR2: положення 70-72 SEQ ID NO: 22, CDR3: положення 109-117 SEQ ID NO: 22, (iv) VH: CDR1: положення 44-51 SEQ ID NO: 18, CDR2: положення 69-76 SEQ ID NO: 18, CDR3: положення 115-125 SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 25, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 25, CDR3: положення 115-122 SEQ ID NO: 25, (v) VH: CDR1: положення 45-52 SEQ ID NO: 17, CDR2: положення 70-77 SEQ ID NO: 17, CDR3: положення 116-126 SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 24, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 24, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 24, (vi) VH: CDR1: положення 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положення 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положення 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 23, CDR2: 24 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положення 76-78 SEQ ID NO: 23, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 23, (vii) VH: CDR1: положення 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положення 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положення 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 26, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 26, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 26, (viii) VH: CDR1: положення 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положення 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положення 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: положення 47-58 SEQ ID NO: 27, CDR2: положення 76-78 SEQ ID NO: 27, CDR3: положення 115-123 SEQ ID NO: 27, і (ix) VH: CDR1: положення 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положення 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положення 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: положення 47-52 SEQ ID NO: 28, CDR2: положення 70-72 SEQ ID NO: 28, CDR3: положення 109-117 SEQ ID NO: 28. У додаткових кращих варіантах здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, бажано містить одну або більше гіперваріабельних ділянок (CDRs), бажано, щонайменше, CDR3 варіабельну ділянку, варіабельної області важкого ланцюга (VH) і/або варіабельної області легкого ланцюга (VL) моноклонального антитіла до CLDN18.2, бажано моноклонального антитіла до CLDN18.2, описаного в даному документі, і бажано містить одну або більше гіперваріабельних ділянок (CDRs), бажано, щонайменше, CDR3 варіабельну ділянку, варіабельних областей важкого ланцюга (VH) і/або варіабельних областей легкого ланцюга (VL), описаних тут. В одному варіанті здійснення зазначений одну або більше гіперваріабельних ділянок (CDRs) обирають із набору гіперваріабельних ділянок CDR1, CDR2 і CDR3, описаних тут. В особливо кращому варіанті здійснення антитіло, яке проявляє здатність зв'язуватися з CLDN18.2, бажано містить гіперваріабельні ділянки CDR1, CDR2 і CDR3 варіабельної області важкого ланцюга (VH) і/або варіабельної області важкого ланцюга (VL) моноклонального антитіла до CLDN18.2, бажано моноклонального антитіла до CLDN18.2, описаного тут, і бажано містить гіперваріабельні ділянки CDR1, CDR2 і CDR3 варіабельних областей важкого ланцюга (VH) і/або варіабельних областей легкого ланцюга (VL), описаних тут. В одному варіанті здійснення антитіло, яке містить одну або більше CDRs, набір CDRs або комбінацію наборів CDRs, як описано тут, включає зазначені CDRs разом з їхніми проміжними каркасними ділянками. Бажано, дана ділянка буде також включати, щонайменше, близько 50 % будь-якої або обох з першої й четвертої каркасних ділянок, причому, будучи на 50 % Cкінцевими 50 % першої каркасної ділянки й N-кінцевими 50 % четвертої каркасної ділянки. Створення антитіл методами рекомбінантних ДНК може призводити до введення N- або Cкінцевих залишків у варіабельні ділянки, які кодуються лінкерами, уведеними для полегшення клонування або інших стадій маніпуляції, включаючи введення лінкерів для з'єднання варіабельних областей винаходу з додатковими білковими послідовностями, включаючи важкі ланцюги імуноглобулінів, інші варіабельні домени (наприклад, при одержанні діабодів) або білкові мітки. В одному варіанті здійснення антитіло, яке містить один або більше CDRs, набір CDRs або комбінацію наборів CDRs, як описано тут, містить зазначені CDRs у каркасній ділянці антитіла людини. Посилання в даному документі на антитіло, яке містить у його важкому ланцюзі конкретний ланцюг або конкретну область (ділянку) або послідовність, бажано відноситься до ситуації, у якій усі важкі ланцюги зазначеного антитіла містять зазначений конкретний ланцюг, область або послідовність. Це відповідно може бути застосовано до легкого ланцюга антитіла. Термін "нуклеїнова кислота", який використовується в описі включає ДНК і РНК. Нуклеїнова кислота може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але бажано є дволанцюговою ДНК. Згідно з винаходом термін "експресія" використовується в його найбільш загальному значенні й включає вироблення РНК або РНК і білка/пептиду. Термін також включає часткову експресію нуклеїнових кислот. Крім того, експресія може протікати тимчасово або постійно. Слід ураховувати, що викладена в документі ідея у відношенні специфічних амінокислотних послідовностей, наприклад, зазначених у списку послідовностей, також має відношення до варіантів зазначених специфічних послідовностей, що призводять до утворення послідовностей, які є функціонально еквівалентними до зазначених специфічних послідовностей, наприклад, амінокислотних послідовностей, які демонструють властивості, ідентичні або подібні, до властивостей специфічних амінокислотних послідовностей. Однією важливою властивістю є збереження зв'язування антитіла з його мішенню або підтвердження ефекторних функцій антитіла. Бажано, послідовність, яка є варіантом відносно специфічної послідовності, у тому випадку, коли вона заміняє специфічну послідовність в антитілі, зберігає здатність зв'язування зазначеного антитіла з CLDN18.2 і бажано функції зазначеного антитіла, як описано тут, наприклад, CDC-опосередкований лізис або ADCC-опосередкований лізис. 25 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фахівцям у даній галузі ясно, що послідовності CDR, гіперваріабельних і варіабельних областей можуть бути модифіковані без втрати здатності зв'язуватися з CLDN18.2. Наприклад, CDR ділянки будуть або ідентичними або високогомологічними до ділянок антитіла, визначеного в описі. Під "високогомологічним" мають на увазі, що може бути зроблено від 1 до 5, бажано від 1 до 4, наприклад від 1 до 3 замін, або 1 або 2 заміни в CDRs. Крім того, гіперваріабельні й варіабельні області можуть бути модифіковані таким чином, щоб вони демонстрували значну гомологію до областей антитіла, зокрема, розкритих в описі. Для цілей даного винаходу "варіанти" амінокислотної послідовності включають варіанти із вставками амінокислот, варіанти з добавками амінокислот, варіанти з делеціями амінокислот і/або варіанти із замінами амінокислот. Варіанти з делеціями амінокислот, які містять делецію на N-кінці й/або C-кінці білка, також називаються N-кінцевими й/або C-кінцевими вкороченими варіантами. Варіанти із вставкою амінокислот включають вставки однієї або двох або більше амінокислот в окрему амінокислотну послідовність. У випадку варіантів, які мають вставку, амінокислотної послідовності в окрему ділянку амінокислотної послідовності вставляється один або більше амінокислотних залишків, хоча за відповідного скринінга отриманого продукту також можна виявити випадкові вставки. Варіанти амінокислотних добавок включають аміно- і/або карбокси-кінцеві злиття з однією або більше амінокислотами, наприклад, з 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше амінокислотами. Варіанти з делецією амінокислот характеризуються видаленням однієї або більше амінокислот з послідовності, наприклад, видаленням 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше амінокислот. Делеції можуть відбуватися в будь-якому місці білка. Варіанти із замінами амінокислот характеризуються, щонайменше, видаленням одного залишку в послідовності й вставкою іншого залишку на його місце. Перевага віддається модифікаціям, які перебувають у положеннях амінокислотної послідовності, які не є консервативними між гомологічними білками або пептидами, і/або замінам амінокислот на інші амінокислоти, що мають подібні властивості. Бажано амінокислотні зміни в білкових варіантах є консервативними амінокислотними змінами, тобто замінами аналогічно заряджених або незаряджених амінокислот. Консервативна зміна амінокислоти має відношення до заміни однієї із родини амінокислот, які є спорідненими за структурою бічного ланцюга. Природні амінокислоти підрозділяються на чотири родини: кислі (аспартат, глутамат), основні (лізин, аргінін, гістидін), неполярні (аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан) і незаряджені полярні (гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин) амінокислоти. Фенілаланін, триптофан і тирозин іноді класифікуються разом як ароматичні амінокислоти. Бажано ступінь подібності, бажано ідентичності між даною амінокислотною послідовністю й амінокислотною послідовністю, яка є варіантом зазначеної даної амінокислотної послідовності, буде становити, щонайменше, близько 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, або 99 %. Ступінь подібності або ідентичності бажано надається для амінокислотної області, яка становить, щонайменше, близько 10 %, щонайменше, близько 20 %, щонайменше, близько 30 %, щонайменше, близько 40 %, щонайменше, близько 50 %, щонайменше, близько 60 %, щонайменше, близько 70 %, щонайменше, близько 80 %, щонайменше, близько 90 % або близько 100 % повної довжини еталонної амінокислотної послідовності. Наприклад, якщо еталонна амінокислотна послідовність складається з 200 амінокислот, ступінь подібності або ідентичність бажано надається, щонайменше, приблизно для 20, щонайменше, приблизно 40, щонайменше, приблизно 60, щонайменше, приблизно 80, щонайменше, приблизно 100, щонайменше, приблизно 120, щонайменше, приблизно 140, щонайменше, приблизно 160, щонайменше, приблизно 180 або приблизно для 200 амінокислот, бажано послідовних амінокислот. У кращих варіантах здійснення надається ступінь подібності або ідентичності до повної довжини еталонної амінокислотної послідовності. Вирівнювання для визначення ступеня подібності послідовності, бажано ідентичності послідовності, можна виконати відомими у даній галузі техніки способами, краще з використанням найкращого способу вирівнювання послідовності, наприклад, Align з використанням стандартних налаштувань, бажано EMBOSS:needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5. "Подібність послідовності" указує відсоток амінокислот, які або є ідентичними або які представляють консервативні амінокислотні заміни. "Ідентичність послідовності" між двома амінокислотними послідовностями визначає відсоток амінокислот, які є ідентичними для даних послідовностей. Термін "відсоток ідентичності" застосовують для позначення відсотка амінокислотних 26 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залишків, ідентичних між двома порівнюваними послідовностями після виконання найбільш оптимального вирівнювання, цей відсоток є чисто статистичним, а відмінності між двома послідовностями розподіляються випадково й у межах їх повної довжини. Порівняння послідовностей між двома амінокислотними послідовностями звичайно здійснюється шляхом порівняння цих послідовностей після їхнього оптимального вирівнювання, зазначене порівняння проводиться за допомогою сегмента або "вікна порівняння" для того, щоб установити й порівняти локальні області подібності послідовності. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, крім способу "вручну", за допомогою алгоритму локальної гомології Smith і Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, за допомогою алгоритму локальної гомології Neddleman і Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, за допомогою методу пошуку подібності Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, або за допомогою комп'ютерних програм із застосуванням цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N і TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.). Відсоток ідентичності вираховується шляхом визначення числа ідентичних положень між двома послідовностями при порівнянні, розділенням цього числа на число порівнюваних положень і множенням отриманого результату на 100 для того, щоб одержати відсоток ідентичності між цими двома послідовностями. Термін "трансгенна тварина" відноситься до тварини, яка має геном, що містить один або більше трансгенів, бажано трансгенів важкого й/або легкого ланцюга, або трансхромосом (або інтегрованих або неінтегрованих у природну геномну ДНК тварини), бажано здатних експресувати трансгени. Наприклад, трансгенна миша може мати трансген людського легкого ланцюга й або трансген людського важкого ланцюга або трансхромосому людському важкому ланцюга, так що миша продукує людські анти-CLDN18.2 антитіла, коли вона імунізована CLDN18.2-антигеном і/або клітинами, які експресують CLDN18.2. Трансген людського важкого ланцюга може бути інтегрований у хромосомну ДНК миші, як у випадку трансгенної миші, наприклад, HuМАb миші, наприклад НСо7 або НСоl2 миші, або трансген людського важкого ланцюга може бути збережений екстрахромосомно, як у випадку трансхромосомних (наприклад, KM) мишей, як описано в WO 02/43478. Такі трансгенні й трансхромосомні миші можуть бути здатні продукувати багато ізотипів людських моноклональних антитіл до CLDN18.2 (наприклад, IgG, IgA і/або IgE) при проведенні V-D-J рекомбінації й перемикання ізотипа. "Зменшувати", "знижувати" або "інгібувати" при використанні в описі означає бути здатним викликати загальне зменшення, бажано на 5 % або більше, 10 % або більше, 20 % або більше, ще краще 50 % або більше й найкраще на 75 % або більше рівня, наприклад, рівня експресії або рівня проліферації клітин. Такі терміни як "збільшення" або "посилення" бажано відносяться до збільшення або посилення, щонайменше, приблизно на 10 %, бажано, щонайменше, на 20 %, бажано, щонайменше, на 30 %, бажано, щонайменше, на 40 %, ще краще, щонайменше, на 50 %, навіть ще краще, щонайменше, на 80 %, і найкраще, щонайменше, на 100 %, щонайменше, на 200 %, щонайменше, на 500 %, щонайменше, на 1000 %, щонайменше, на 10 000 % або навіть більше. Механізми дії mАb Незважаючи на те, що наступний опис пропонує обговорення, стосовно механізму, який лежить в основі терапевтичної ефективності антитіл винаходу, він не повинен розглядатися як такий, що обмежує винахід яким би то не було чином. Описані тут антитіла бажано взаємодіють із компонентами імунної системи, переважно через ADCC або CDC. Описані тут антитіла також можуть використовуватися для "цільового навантаження" (наприклад, радіоізотопами, лікарськими засобами або токсинами), для того, щоб безпосередньо вбивати пухлинні клітини, або можуть використовуватися синергійно разом із традиційними хіміотерапевтичними засобами, впливаючи на пухлини за допомогою додаткових механізмів дії, включаючи протипухлинні імунні відповіді, які можуть бути порушені внаслідок побічних цитотоксичних ефектів хіміотерапевтичних препаратів на T-лімфоцити. Однак, описані тут антитіла також можуть діяти просто шляхом зв'язування з CLDN18.2 на клітинній поверхні, таким чином, наприклад, блокуючи проліферацію клітин. Антитілозалежна клітинноопосредкована цитотоксичність ADCC описує здатність ефекторних клітин, як описано тут, зокрема, лімфоцитів, убивати клітини, при цьому необхідно, щоб клітина-мішень була бажано позначена антитілом. Бажано ADCC спостерігається, коли антитіла зв'язуються з антигенами на пухлинних клітинах, а Fc-домени антитіл зв'язують Fc-рецептори (FcR) на поверхні імунних ефекторних клітин. Було встановлено кілька родин Fc-рецепторів, при цьому характерно, що специфічні популяції клітин експресують певні Fc-рецептори. ADCC можна розглядати як механізм прямого 27 UA 115985 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 руйнування (різного ступеню) пухлини, який призводить до презентації антигену й індукції Тклітинних відповідей, спрямованих на пухлину. Бажано індукція ADCC in vivo буде призводити до Т-клітинної відповіді, спрямованої на пухлинні клітини, і відповіді антитіл хазяїна. Комплементзалежна цитотоксичність. Іншим способом знищення клітин, який може бути опосередкований антитілами, є CDC. Найефективнішим ізотипом для активації комплементу є IgM. Також дуже ефективними при спрямовуванні CDC класичним шляхом активації комплементу є IgGl і IgG3. Бажано утворення комплексів антиген-антитіло в цьому каскаді призводить до "розкриття" численних місць зв'язування Clq у безпосередній близькості на СН2 доменах молекул антитіл, які беруть в цьому участь, наприклад, молекул IgG (Clq є одним із трьох субкомпонентів комплементу Cl). Бажано ці "розкриті" місця зв'язування Clq перетворюють взаємодію Сlq-IgG, яке до цього мало низьку спорідненість на спорідненість із високої авідністю, що запускає каскад подій, які залучають ряд інших білків комплементу, і призводить до протеолітичного вивільненню хемотаксичних/активуючих агентів, ефекторних клітин C3a і C5a. Бажано каскад комплементу кінчається утворенням мембрано-атакуючого комплексу, який створює пори в клітинній мембрані, які сприяють вільному проходженню води й розчинених речовин у клітини й із клітин. Описані в цьому документі антитіла можна одержати за допомогою ряду методів, включаючи звичайну методику одержання моноклональних антитіл, наприклад, методом гібридизації стандартних соматичних клітин Kohler і Milstein, Nature 256: 495 (1975). Незважаючи на те, що методи гібридизації соматичних клітин є кращими, у принципі можна використовувати інші методи одержання моноклональних антитіл, наприклад, шляхом вірусної або онкогенної трансформації B-лімфоцитів, або метод фагового дисплею з використанням бібліотек генів антитіл. Кращою тваринною системою для одержання гібридоми, яка секретує моноклональні антитіла, є мишача система. Одержання гібридом в миші є загальноприйнятим методом. Протоколи імунізації й методики виділення імунізованих спленоцитів для злиття добре відомі у даній галузі техніки. Клітини, що зливаються (наприклад, мишачі клітини мієломи) і процедури злиття також добре відомі. Іншими кращими тваринними системами для одержання гібридом, які секретують моноклональні антитіла, є пацюки або кролики (наприклад, система, описана в Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), дивися також Rossi et al., Am. J. Clin. 35 Pathol. 124:295(2005)). В іншому кращому варіанті здійснення людські моноклональні антитіла можна одержати за допомогою трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть частини людської імунної системи, а не мишачої системи. Ці трансгенні або трансхромосомні миші включають мишей, відомих як миші HuМАb і миші KM, відповідно, і які разом згадуються в описі як "трансгенні миші". Одержання людських антитіл у таких трансгенних мишах можна здійснити, як докладно описано для CD20 в WO2004 035607. Іншою стратегією одержання моноклональних антитіл є пряме виділення генів, які кодують антитіла, з лімфоцитів, які продукують антитіла, наприклад, див. Babcock et el., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antiboies of defined strategy. Подробиці розробки рекомбінантних антитіл дивися також в Welschof і Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 і Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1. Для одержання антитіл мишей можна імунізувати кон'югованими з носієм, пептидами отриманими з послідовності антигену, тобто послідовності, проти якої спрямовані антитіла, збагаченими препаратом рекомбінантно експресованого антигену або його фрагментів і/або клітинами, які експресують антиген, як описано. Альтернативно, мишей можна імунізувати ДНК, яка кодує антиген або його фрагменти. У тому випадку, коли імунізація з використанням очищеного або збагаченого препарату антигену не призводить до утворення антитіл, мишей також можна імунізувати клітинами, які експресують антиген, наприклад, клітинною лінією, щоб сприяти імунній відповіді. Імунну відповідь можна контролювати протягом виконання протоколу імунізації, відбираючи зразки плазми й сироватки із хвостової вени або ретроорбітального кровотоку. Миші з достатнім титром імуноглобуліну можуть використовуватися для злиття клітин. Мишей можна піддавати стимуляції внутрішньоочеревинно й внутрішньовенно клітинами, які експресують антиген, за 3 дні до забою й видалення селезінки для того, щоб збільшити швидкість секретування специфічних антитіл гібридомами. Для одержання гібридом, які продукують моноклональні антитіла, з лімфатичних вузлів або селезінки, отриманих від імунізованих мишей, можуть бути виділені клітини й злиті з придатною 28

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer

Автори англійською

Sahin, Ugur, Tureci, Ozlem, Mitnacht-Kraus, Rita, Jacobs, Stefan Denis, Utsch, Magdalena Jadwiga, Heinz, Cornelia Adriana Maria, Stadlir, Christiane, Regina

Автори російською

Сахин Угур, Тюречи Эзлем, Митнахт-Краус Рита, Якобс Штэфан Дэнис, Уч Магдалена Ядвига, Хайнц Корнелия Адриана Мария, Штадлер Кристианэ Регина

МПК / Мітки

МПК: A61K 31/663, A61K 38/20, A61K 39/395

Мітки: спосіб, запобігання, шлунка, лікування, раку

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/100-115985-sposib-likuvannya-abo-zapobigannya-raku-shlunka.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб лікування або запобігання раку шлунка</a>

Подібні патенти